張智　唐娜　王玨　趙志河　譚理軍.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學），成都 6004；.四川省人民醫(yī)院口腔科，成都 6007

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脈沖超聲及電磁場對大鼠骨髓間充質干細胞體外成軟骨分化過程中細胞外基質溢出的影響

張智1唐娜2王玨1趙志河1譚理軍1
1.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學），成都 610041；2.四川省人民醫(yī)院口腔科，成都 610072

[摘要]目的研究脈沖超聲以及脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質干細胞微球體外成軟骨分化中細胞外基質向培養(yǎng)基中溢出的影響。方法將干細胞微球在成軟骨培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分為無刺激組（N組）、脈沖超聲（100、150、200 mW·cm-2）刺激組和脈沖電磁場（1、2、5 mT）刺激組。2周后采用酶聯免疫吸附測定法檢測培養(yǎng)液中Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的質量濃度。結果脈沖超聲刺激組細胞外基質分泌較N組增多（P<0.05），但3個刺激組間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；脈沖電磁場組對Ⅱ型膠原分泌無明顯影響（P>0.05），1 mT組對糖胺聚糖的分泌無明顯影響（P>0.05），2 mT和5 mT組糖胺聚糖的分泌減少（P<0.05）。結論在促進干細胞成軟骨分化的過程中，特定參數的脈沖電磁場可能起到防止增多的細胞外基質向組織外擴散溢出的作用。

[關鍵詞]脈沖超聲； 脈沖電磁場； 成軟骨分化； 細胞外基質

Supported by: National Natural Science Foundation of China (30900287, 81030034, 30900286).Correspondence: Tan Lijun, E-mail: orthotan@vip.163.com.

干細胞的成軟骨分化過程與物理刺激緊密相關。脈沖超聲（pulsed ultrasound，PUS）和脈沖電磁場（pulsed electromagnetic fields，PEMF）作為非侵入性的物理刺激，具有極佳的應用前景[1-3]。El-Bialy 等[4]提取新西蘭兔股骨中的骨髓間充質干細胞，擴增后接種到膠原蛋白支架中，4周后，PUS刺激組番紅-O染色增強。Schumann等[5]使用成軟骨培養(yǎng)基體外成軟骨誘導人的骨髓間充質干細胞微球，并在前7 d對實驗組施加PUS刺激，結果發(fā)現，每日40 min的PUS刺激組成軟骨相關基因的表達除了在最初7 d降低外，之后都明顯增加。Esposito等[6]在體外通過成軟骨誘導結合Wharton’s膠的人臍帶血來源間充質干細胞，發(fā)現PEMF明顯縮短成軟骨分化的時間，表明PEMF具有早期誘導臍帶血來源間充質干細胞成軟骨分化的潛力。Chen等[7]將人脂肪源性干細胞接種于羥磷灰石和膠原蛋白支架進行成軟骨誘導，使用PEMF刺激1周，結果發(fā)現，每日8 h的PEMF刺激可以使SRY基因相關高遷移率組家族-9、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖基因的表達增加，促進ADSCs的成軟骨分化。由此可見，現有的多數體外研究均已證實PUS和PEMF可以促進干細胞成軟骨分化過程中軟骨特征性細胞外基質合成。然而，在體外研究中細胞外基質合成后，除了存在于培養(yǎng)體內部，一部分還會被分泌到培養(yǎng)基中，以往的實驗研究都忽略了這一重要組成部分。研究這部分細胞外基質，可以探討PUS和PEMF是否有助于軟骨樣細胞外基質儲存于培養(yǎng)體中?；谶@種設想，本實驗以經典的無支架細胞微球為成軟骨研究模型[8]，采用臨床常用的PUS和PEMF參數設置，通過酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）研究PUS及PEMF對大鼠骨髓間充質干細胞體外成軟骨分化，細胞外基質Ⅱ型膠原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分泌的影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物

1月齡雄性SD大鼠，由四川大學實驗動物中心提供。本實驗中對實驗動物的處置符合動物倫理學要求。

1.2細胞微球培養(yǎng)

脫頸處死大鼠，將股骨及脛骨骨髓組織懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后半換液棄去不貼壁的細胞，2 d全換液，之后每隔2～3 d換液，待原代細胞（P0）貼壁融合達80%～90%后，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。使用流式細胞儀檢測P3細胞表面抗原標志物CD34、CD29、CD44 及CD45表達。使用P3細胞進行實驗，每個15 mL無菌離心管移入約5×105個細胞，1 000 r·min-1離心5 min，細胞沉淀后，加入成軟骨誘導液，于37 ℃、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)24 h，細胞沉淀聚集成球狀。

1.3PUS干預

將細胞微球培養(yǎng)2 d后轉移至6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每個孔加入2.5 mL成軟骨誘導培養(yǎng)基，10個細胞微球，隨機分為無刺激組（N組）和刺激組（US組）。US組按刺激強度分為100、150、200 mW·cm-2共3組（分別為US1、US2、US3組），設置參數為：占空比20%，工作頻率1 mHz，重復頻率1 kHz，15 min·d-1。N組每天處理方式相同，但是不開電源。

1.4PEMF干預

將細胞微球培養(yǎng)2 d后轉移至24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔加1 mL成軟骨誘導培養(yǎng)基及4個細胞微球，設無刺激組（N組）和刺激組（PS組）。PS組按強度分為5、2和1 mT共3組（分別為PS1、PS2、PS3組），調制頻率為750 Hz，載波頻率為75 Hz，3 h·d-1。N組每天處理方式相同，但不開電源。

1.5ELISA檢測

培養(yǎng)2周后收集各組培養(yǎng)液，編號后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測時先通過離心提取上清液，然后進行ELISA反應。按照預實驗結果，樣本可直接用于GAG的檢測，稀釋100倍后可用于Ⅱ型膠原蛋白的檢測。反應終止后30 min內置于酶標儀450 nm下讀取光密度（optical density，OD）值，根據標準品的濃度和OD值繪制標準曲線。在曲線上根據樣本OD值查找出樣本中該物質的濃度，由此檢測各組細胞分泌Ⅱ型膠原和GAG的含量。

1.6統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，對結果進行t檢驗、單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2　結果

2.1細胞形態(tài)學觀察及細胞表型鑒定

原代培養(yǎng)72 h后，貼壁細胞數量明顯增多，多數梭形細胞聚集成團，呈現克隆樣生長的特點。培養(yǎng)5 d時，細胞相互融合，成片生長。經過2次傳代后，P2代細胞均為成纖維細胞樣細胞，長梭形并帶有多個細胞質突起，保持克隆樣生長的特點，生長迅速，2～3 d即可以相互融合成片，局部成漩渦樣。原代培養(yǎng)的P3代大鼠骨髓間充質干細胞表面抗原表達情況如下：CD34表達陰性（0.2%），CD45表達陰性（0.0%），CD29表達陽性（99.7%），CD44表達陽性（52.5%）。

2.2PUS干預對軟骨基質分泌的影響

培養(yǎng)2周后收集的培養(yǎng)基內含細胞微球最近3 d的代謝產物，經ELISA檢測，結果顯示：US組和N組Ⅱ型膠原質量濃度的總體均數為116.309 μg·mL-1，遠高于GAG（2.483 μg·mL-1），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1　PUS對干細胞微球成軟骨誘導2周時上清液中細胞外基質質量濃度的影響Fig 1　The effect of PUS on the content of extracellular matrix in the medium after 2 week

2.2.1PUS干預對Ⅱ型膠原分泌的影響PUS干預下，N、US1、US2、US3組分泌Ⅱ型膠原的質量分數分別為93.331、127.968、122.636、121.303 μg·mL-1（圖1）。經單因素方差分析，4組質量分數的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步行SNK檢驗，US1、US2、US3組間的差異無統(tǒng)計學意義，但3個組與N組間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2　PEMF對干細胞微球成軟骨誘導2周時上清液中細胞外基質含量的影響Fig 2　The effect of PEMF on the content of extracellular matrix in the medium after 2 weeks

2.2.2PUS干預對GAG分泌的影響在PUS干預下，N、US1、US2、US3組分泌GAG的質量分數分別為1.782、2.772、2.739、2.640 μg·mL-1（圖1）。經單因素方差分析，4組質量分數的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步行SNK檢驗，US1、US2、US3組間的差異無統(tǒng)計學意義，但3個組與N組間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3PEMF干預對軟骨基質分泌的影響

培養(yǎng)2周時細胞培養(yǎng)上清液中，PS組和N組的Ⅱ型膠原蛋白質量濃度總體均數為88.743 μg·mL-1，遠高于GAG（1.155 μg·mL-1，P＜0.05）（圖2）。

2.3.1PEMF干預對Ⅱ型膠原分泌的影響PEMF干預下，N、PS3、PS2、PS1組分泌Ⅱ型膠原的質量分數分別為92.334、87.763、90.935、83.940 μg·mL-1（圖2）。經單因素方差分析，4組質量分數均值的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示PEMF對Ⅱ型膠原分泌無明顯影響。

2.3.2PEMF干預對GAG分泌的影響PEMF干預下，N、PS3、PS2、PS1組分泌GAG的質量濃度分別為1.785、1.470、0.700、0.666 μg·mL-1（圖2）。經單因素方差分析，4組質量分數的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；進一步行SNK檢驗，N組和PS3組中任一組GAG質量濃度與PS2和PS1組的任一組均有差異，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

由軟骨細胞分泌的細胞外基質的主要成分為Ⅱ型膠原和GAG。細胞外基質沉積在細胞周圍，為軟骨細胞提供三維網狀結構，有利于關節(jié)軟骨細胞表型的穩(wěn)定[9]。Ⅱ型膠原和GAG表達的程度代表穩(wěn)定分化的軟骨細胞的功能活躍情況。其中，Ⅱ型膠原是透明軟骨的特征性細胞外基質[10]，是軟骨細胞的特異性標志之一；GAG的代謝與軟骨細胞的功能狀態(tài)有密切關系。物理刺激可直接或間接影響干細胞成軟骨過程中Ⅱ型膠原合成及GAG合成及釋放[4-7]，因此定性定量研究干細胞成軟骨分化過程中軟骨細胞外基質的Ⅱ型膠原和GAG的變化情況，是研究物理刺激對干細胞成軟骨分化影響的重要途徑之一。研究[8]證實，物理刺激在干細胞成軟骨分化過程中可以促進成軟骨培養(yǎng)體內細胞外基質的合成。物理刺激是否有利于合成的細胞外基質儲存在培養(yǎng)體內，防止溢出到培養(yǎng)基中尚缺乏科學的證明。

本研究發(fā)現，PUS促進了成軟骨分化的干細胞微球向培養(yǎng)基中溢出Ⅱ型膠原和GAG。本研究還對不同強度PUS的促進效果進行了比較，結果發(fā)現，100、150、200 mW·cm-2這3種強度的PUS相互之間的刺激作用無明顯差異，尚不能認為PUS的強度會影響細胞外基質向培養(yǎng)基中溢出。本課題組在前期研究[11]中發(fā)現，100、150和200 mW·cm-2的超聲均可使培養(yǎng)體內部番紅-O染色增強，促進Ⅱ型膠原蛋白的表達，尤其是在150、200 mW·cm-2的刺激下，Ⅱ型膠原蛋白的表達明顯高于100 mW·cm-2。由此可見，在本研究設置下，PUS可以促進干細胞成軟骨培養(yǎng)體系內軟骨相關細胞的細胞外基質合成和溢出增多，但是溢出增多的比例低于其合成增加的比例，尤其是在150和200 mW·cm-2的超聲刺激下。

1、2、5 mT PEMF刺激對干細胞微球向培養(yǎng)基中合成分泌Ⅱ型膠原無顯著影響，2、5 mT組降低了干細胞微球向培養(yǎng)基中分泌GAG。本課題組在前期研究[12]中發(fā)現，只有5 mT的PEMF可使培養(yǎng)體內GAG表達降低，1、2 mT的PEMF對GAG的表達無明顯影響，同時PEMF對培養(yǎng)體內Ⅱ型膠原的表達也無明顯影響。結合本研究結果可見，PEMF在促進干細胞成軟骨分化并合成細胞外基質的同時，2 mT 的PEMF刺激可能參與阻止其向培養(yǎng)基中溢出。

本研究發(fā)現，PUS可以促進成軟骨分化干細胞微球向培養(yǎng)基中分泌Ⅱ型膠原和GAG，其促進作用強于PEMF，并且與PUS強度無關。PEMF在促進干細胞成軟骨分化的過程中，其機制可能不僅僅局限于促進軟骨樣細胞外基質的合成，還可能參與了防止增多的細胞外基質向組織外溢出的作用，從而更有效地促進細胞微球等培養(yǎng)體成軟骨分化；但其具體機制還有待進一步的研究證實。

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（本文編輯吳愛華）

·口腔微生物學專欄·

Effects of pulsed ultrasound and pulsed electromagnetic field on the extracellular matrix secretion of rat bone marrow mesenchymal stem cell pellets in chondrogenesis

Zhang Zhi1, Tang Na2, Wang Jue1, Zhao Zhihe1, Tan Lijun1.(1.State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept.of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China;2.Dept.of Stomatology, People’s Hospital, Sichuan Province, Chengdu 610072, China)

[Key words]pulsed ultrasound;pulsed electromagnetic field;chondrogenesis;extracellular matrix

[Abstract]Objective To study the effects of pulsed ultrasound (PUS) and pulsed electromagnetic fields (PEMF) on the secretion of extracellular matrix from a culture complex during in vitro chondrogenesis.MethodsAll the rat bone marrow mesenchymal stem cell pellets were cultured in achondrogenic medium.Different intensities of PUS (100, 150, and 200 mW·cm-2) and PEMF (1, 2, and 5 mT) were applied to the cell pellets for 2 weeks.Group N was cultured without PUS and PEMF stimulation as control.The culture medium was collected after 2 weeks of culture.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the type of collagen and glycosaminoglycan (GAG) in the culture medium.ResultsPUS increased the secreting-type collagen and GAG from cell pellets compared with group N (P<0.05), whereas there was no difference in different intensities (P>0.05).PEMF had no significant effect on the secretion of the type of collagen (P>0.05).A PEMF of 1 mT had no significant effect on the secretion of GAG (P>0.05).A PEMF 2 and 5 mT decreased the secretion of GAG (P<0.05).ConclusionTo prevent the secretary of extracellular matrix may play a role in chondrogenic effect of PEMF.

[中圖分類號]R 783.5

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.015

[收稿日期]2015-12-16； [修回日期]2016-02-01

[基金項目]國家自然科學基金（30900287，81030034，30900286）

[作者簡介]張智，碩士，E-mail：263687654@qq.com

[通信作者]譚理軍，副教授，博士，E-mail：orthotan@vip.163.com