車春曉　姜科宇　馬媛媛　曾颯　周建業(yè)　李志強　何祥一.蘭州大學口腔醫(yī)學研究所，蘭州 730000；.甘肅省口腔疾病研究重點實驗室（西北民族大學），蘭州 730030

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針對變異鏈球菌的人源特異性靶向抗菌肽C16LL-37的生物學特性

車春曉1姜科宇1馬媛媛1曾颯1周建業(yè)2李志強2何祥一1
1.蘭州大學口腔醫(yī)學研究所，蘭州 730000；2.甘肅省口腔疾病研究重點實驗室（西北民族大學），蘭州 730030

[摘要]目的研究針對變異鏈球菌（S.mutans）的人源特異性靶向抗菌肽C16LL-37的生物學特性。方法通過標準固相合成技術（Fmoc保護法）合成人源抗菌肽LL-37、S.mutans感受態(tài)刺激肽（CSP）C端16個氨基酸組成的多肽CSPC16及二者的重組多肽C16LL-37；以LL-37、CSPC16為對照組，采用平板菌落計數法檢測C16LL-37對S.mutans、黏性放線菌、大腸埃希菌、嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性及其對S.mutans的靶向性。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，濃度為32 μmol·L-1的C16LL-37作用后S.mutans的細胞形態(tài)學變化；利用酶聯免疫吸附法測定C16LL-37的紅細胞溶血率以及不同條件對C16LL-37抗菌活性的影響。結果1）C16LL-37對S.mutans的最小抗菌濃度為16 μmol·L-1，最小殺菌濃度為64 μmol·L-1。2）C16LL-37濃度為64 μmol·L-1時，作用30 min后S.mutans存活率為3.46%，作用60 min后細菌存活率降至0%，其他4種細菌在各時間的存活率均大于60%（P＜0.05）。3）SEM觀察：經C16LL-37 （32 μmol·L-1）作用后，部分S.mutans細胞形態(tài)出現不規(guī)則改變，部分細胞的細胞膜粗糙、細胞質外溢或出現細胞裂解。4）C16LL-37濃度不超過64 μmol·L-1時，紅細胞溶血率低于0.33%，與陰性對照組無明顯差異（P＞0.05）。5）不同溫度、pH值、鹽濃度及低濃度胰蛋白酶處理后，C16LL-37的抗菌活性無明顯變化（P＞0.05）。結論C16LL-37對變異鏈球菌具有靶向特異性，并且具有較強的抗菌活性、較高的生物安全性及良好的穩(wěn)定性。

[關鍵詞]變異鏈球菌； 感受態(tài)刺激肽； 抗菌肽； 特異性靶向抗菌肽

Supported by: Fund for Less Developed Regions ofNatural Science Foundation of China (31160124/C0309);Natural Science Foundation of Gansu Province (1204FKCA16, 1308RJZA248).Correspondence: He Xiangyi, E-mail: hexy@lzu.edu.cn.

齲病是最常見的口腔慢性感染性疾病。變異鏈球菌是人類齲病最主要的致病菌[1-2]，抑制變異鏈球菌的增殖對阻斷齲病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

抗菌肽是一種具有生物活性的小分子多肽，主要破壞細菌細胞膜，使細菌內容物外溢導致細菌死亡，這一抗菌機制賦予了其不易產生耐藥性，對大多數耐藥微生物具較強抗菌活性的優(yōu)勢[3-4]；但抗菌肽也存在抗菌譜廣、生物效能低、篩選難度高及蛋白水解不穩(wěn)定等缺點。隨著臨床耐藥致病菌日趨增多，研發(fā)具備較強抗菌活性的特異性靶向抗菌肽（specifically targeted antimicrobial peptides，STAMP）尤為迫切[5]。人源抗菌肽LL-37是如今唯一發(fā)現的具有α-螺旋結構的Cathelicidins家族抗菌肽[6-7]，不僅具備極高的生物安全性，且不易導致病原菌發(fā)生抗性突變，是新型抗生素設計及合成的理想模板和分子骨架[7-8]。

STAMP由靶向定位區(qū)域、抗菌區(qū)域和（或）連接體區(qū)域組成。STAMP通過靶向定位區(qū)域增加目標細菌表面抗菌肽濃度，使抗菌肽的殺傷效力及動態(tài)性能全面提升[9-10]。Guo等[9]以變異鏈球菌感受態(tài)刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）C端16個氨基酸序列作為靶向定位區(qū)域即CSPC16，通過連接體（-GGG-）與抗生素Novinspirin G2連接合成新型抗菌肽C16G2。C16G2對變異鏈球菌有靶向特異性，抗菌活性強[9,11]；但Novinspirin G2作為化學合成抗生素，具有一定的細胞毒性[12]。

本研究以LL-37為抗菌區(qū)域，以變異鏈球菌CSPC16為靶向定位區(qū)域合成一種人源重組抗菌肽C16LL-37，并對其靶向特異性、抗菌活性、生物安全性及穩(wěn)定性等生物學特性進行研究。

1　材料和方法

1.1設備與材料

主要設備：全自動菌落計數器（北京起航博達科技有限公司），S-3400N型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM，日本日立高新技術公司），DG5033A型酶聯免疫檢測儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司）。主要試劑：MH肉湯（Mueller-Hinton broth，MHB）培養(yǎng)基、MH瓊脂（Mueller-Hinton agar，MHA）培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術有限公司）。標準菌株：變異鏈球菌ATCC25175、黏性放線菌ATCC15987、大腸埃希菌ATCC25922、嗜酸乳桿菌ATCC4356、金黃色葡萄球菌ATCC25923，各標準菌株均由甘肅省口腔疾病研究重點實驗室培育基地提供。

1.2實驗方法

1.2.1多肽的合成及細菌懸液的配置多肽CSPC16、LL-37、C16LL-37由蘭州大學化學化工學院采用標準固相合成技術（Fmoc保護法）合成，應用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）純化，應用電噴霧電離質譜對純化產物進行鑒定，要求多肽純度≥95%（表1）。將各多肽溶解于無菌去離子水中配置成母液，濃度為5 120 μmol·L-1，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1　多肽的氨基酸序列、純度及相對分子質量Tab 1　Amino acid sequence, purity and relative molecular mass of peptides

將凍存的各細菌復蘇后置于恒溫搖床（37 ℃，120 r·min-1）過夜培養(yǎng)，通過麥氏標準比濁法，測定濁度于0.5～1.0之間（1×108CFU·mL-1），利用MHB培養(yǎng)基將各菌液稀釋至1×106CFU·mL-1，備用。

1.2.2抗菌活性實驗通過抗菌活性實驗比較并分析3種多肽對各細菌的最小抗菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[13]。設LL-37為陽性對照組，CSPC16及MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，C16LL-37為實驗組。采用二倍梯度稀釋法將LL-37、CSPC16及C16LL-37母液分別稀釋至256、128、64、32、16、8 μmol·L-1。取不同濃度抗菌肽分別加至含5種細菌懸液（1×106CFU·mL-1）的各無菌離心管內（每支100 μL），充分混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h。2 h后，將每組樣品行1×103倍稀釋，并各取30 μL分別均勻涂布于MHA平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～18 h。利用菌落計數儀計數，計算各組細菌的存活率。各組實驗均設3個平行。

1.2.3C16LL-37對變異鏈球菌靶向特異性的測定設變異鏈球菌為實驗組，其他4種細菌為對照組。將濃度為64 μmol·L-1的C16LL-37加至分別含5種細菌懸液（1×106CFU·mL-1）的無菌離心管內（每支100 μL），充分混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，分別以30、60、120 min為兩種抗菌肽作用觀察時間點。菌落計數法同1.2.2。各組實驗均設3個平行。

1.2.4時間—殺菌實驗 分別選取100 μL稀釋后的C16LL-37（16、32、64 μmol·L-1）加至含100 μL變異鏈球菌懸液（1×106CFU·mL-1）的無菌離心管內，充分混勻，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，分別以0、30、60、90、120、150 min為C16LL-37作用觀察時間點。菌落計數法同1.2.2。各組均設3個平行。

1.2.5紅細胞溶血實驗 設0.2% TritonX-100為陽性對照組，PBS為陰性對照組。經知情同意后取健康人（血檢合格）新鮮靜脈血4.5 mL分裝至含1 g·L-1肝素鈉的無菌離心管內（每支1.5 mL），離心（1 000 g，10 min）后棄上清，PBS清洗2～3次后，配制成體積分數4%的紅細胞懸液。將紅細胞懸液分別加至含不同濃度（256、128、64、32、16、8 μmol·L-1）C16LL-37及LL-37的96孔聚苯乙烯板各孔內（每孔100 μL），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h。2 h后離心（1 000 g，10 min），取上清，利用酶標儀檢測各孔內上清的吸光度A值（450 nm）。各孔均設3個平行。

1.3SEM觀察

設MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，LL-37為陽性對照組。取500 μL C16LL-37（64 μmol·L-1）加至含500 μL變異鏈球菌懸液（1×106CFU·mL-1）的無菌離心管內，充分混勻（C16LL-37終濃度32 μmol·L-1），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，離心（10 000 r·min-1，5 min），棄上清，PBS清洗2～3次。向各樣品中分別加入2.0%戊二醛緩沖劑于4 ℃條件下固定24 h，PBS清洗2～3次，乙醇梯度脫水，100%叔丁醇置換乙醇 2～3次，最終溶于100%叔丁醇。吸取細菌—叔丁醇懸液滴于覆有蓋玻片的樣品臺，置冷凍干燥機內真空干燥，噴金，SEM觀察[14]。各組均設3個平行。

1.4C16LL-37的穩(wěn)定性分析

1.4.1不同溫度 以C16LL-37作為陽性對照組。將C16LL-37（64 μmol·L-1）分別置于17、27、37、47、57 ℃條件下處理30 min，再將各組樣品置于恒溫孵育箱30 min后使其溫度恢復至37 ℃。

1.4.2不同pH值設HCl及NaOH緩沖液為陰性對照組，C16LL-37為陽性對照組。分別利用HCl及NaOH緩沖液將3組C16LL-37（64 μmol·L-1）的pH值調至5.5、6.5、7.5。

1.4.3不同濃度鹽設各濃度的鹽作為陰性對照組，C16LL-37為陽性對照組。向C16LL-37（64 μmol·L-1）中分別加入不同濃度的NaCl溶液，充分混勻，使各組C16LL-37中NaCl的濃度分別為100、200、300、400 μmol·L-1。

1.4.4不同濃度胰蛋白酶以MHB培養(yǎng)基作為陰性對照組，以未處理的C16LL-37（64 μmol·L-1）作為陽性對照組。將C16LL-37分別采用不同濃度（2、20、200、2 000 μmol·L-1）的胰蛋白酶處理6 h。

取經上述處理后的C16LL-37 各100 μL分別加至含100 μL變異鏈球菌懸液（1×106CFU·mL-1）的96孔聚苯乙烯板各孔內，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標儀檢測各組的吸光度A值（600 nm），各孔均設3個平行。

1.5統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行t檢驗分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2　結果

2.1抗菌活性實驗

抗菌活性實驗結果見表2：5種標準菌對C16LL-37的敏感性較LL-37均減弱；但相對其他4種細菌，變異鏈球菌對C16LL-37的敏感性最強（MIC=16 μmol·L-1，MBC=64 μmol·L-1）（P＜0.05）；CSPC16的抗菌活性與陰性對照組沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.2C16LL-37對變異鏈球菌的靶向特異性測定

C16LL-37（64 μmol·L-1）作用30 min后，變異鏈球菌的存活率明顯下降（3.46%），60、120 min后變異鏈球菌的存活率為0%；其他4種細菌在各培養(yǎng)時間的存活率均大于60% （P＜0.05） （圖1）。

2.3時間—殺菌實驗

C16LL-37濃度為4倍MIC（即64 μmol·L-1）時，作用于變異鏈球菌60 min后，可以殺滅全部細菌；150 min后細菌存活率仍為0。C16LL-37濃度為2倍MIC（32 μmol·L-1）時，在60 min內抗菌效果最為明顯，細菌存活率小于10%；C16LL-37濃度為1倍MIC（16 μmol·L-1）時，抗菌活性最弱，120 min后細菌呈增殖趨勢（圖2）。

表2　3種多肽抗菌活性實驗Tab 2　Antimicrobial activity of three kinds of peptides　μmol·L-1

圖1　C16LL-37對變異鏈球菌的靶向特異性Fig 1　The specificity of C16LL-37 against Streptococcus mutans

2.4SEM觀察

用濃度為32 μmol·L-1的C16LL-37作用于變異鏈球菌2 h后，置于SEM下觀察，結果可見：變異鏈球菌正常形態(tài)呈球狀或短棒狀，表面光滑完整（圖3A、B）；C16LL-37作用后，部分細菌細胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變（圖3C），細胞膜粗糙，細胞質外溢（圖3D）或細胞裂解，可見大量細胞外碎屑（圖3E）；部分細菌與陰性對照組細胞相似，未見細胞裂解或碎屑形成（圖3F）。

圖2　不同濃度C16LL-37對變異鏈球菌ATCC25175的時間—殺菌曲線Fig 2　The time-kill curves of different concentrations of C16LL-37 against Streptococcus mutans ATCC25175

圖3　變異鏈球菌ATCC25175的細胞形態(tài)學變化　SEM　× 15 000Fig 3　Morphological observation of Streptococcus mutans ATCC25175　SEM　× 15 000

2.5紅細胞溶血實驗

C16LL-37、LL-37的紅細胞溶血率見圖4，兩種多肽的溶血率與陰性對照組均沒有明顯差異（P>0.05）。當濃度為32 μmol·L-1時，C16LL-37的溶血率為0.16%, LL-37為0.24%；濃度為64 μmol·L-1時，C16LL-37溶血率為0.33%，LL-37為0.38%；濃度達到128、256 μmol·L-1時，C16LL-37和LL-37的溶血率仍低于30%。

圖4　C16LL-37、LL-37的紅細胞溶血實驗Fig 4　The hemolysis assay of C16LL-37 and LL-37

2.6C16LL-37的穩(wěn)定性分析

不同溫度、pH值、鹽濃度及較低濃度的胰蛋白酶（2、20 μmol·L-1）處理后，C16LL-37的抗菌效果與陽性對照組無明顯差異（P＞0.05）；但較高濃度胰蛋白酶（200、2 000 μmol·L-1）處理后，C16LL-37的抗菌活性減弱（P＜0.05，圖5）。

圖5　不同濃度胰蛋白酶處理后C16LL-37對變異鏈球菌 ATCC-25175的抗菌活性ig 5　The antibacterial activity of C16LL-37 against Streptococcus mutans ATCC25175 after treatment by trypsin at different con-centrations

3　討論

20世紀初，化學合成抗生素的問世極大地推動了齲病預防工作的進程。近年來，由于抗生素的濫用，口腔菌群失衡和耐藥致病菌增多等問題接踵而至[15-16]。研發(fā)出一種安全有效且能靶向抑制口腔致病菌生長繁殖的新型抗生素迫在眉睫。本研究以變異鏈球菌CSP的C端16個氨基酸序列（CSPC16）為靶向定位區(qū)域，以人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列為抗菌區(qū)域，兩者通過連接體（-GGG-）連接，成功地合成了人源特異性靶向抗菌肽C16LL-37。

CSP具有介導細菌進入基因感受態(tài)，影響細胞聚集、黏附等重要作用[17-18]。Syvitski等[19]通過對CSP的構效分析發(fā)現，CSP的C端區(qū)域穩(wěn)定，去除部分氨基酸殘基后仍能競爭性抑制變異鏈球菌的密度感應，證明CSP的C端更適合作為變異鏈球菌特異性靶向抗菌肽的靶向定位區(qū)域。Mai等[20]將從比目魚表皮中分離的多肽Pleurocidin的變異體NRC-4為抗菌區(qū)域，以CSP的C端部分氨基酸序列為靶向定位區(qū)域，合成了變異鏈球菌特異性靶向抗菌肽IMB-2，并對其結構及生物活性分析，結果發(fā)現：IMB-2對變異鏈球菌具有靶向特異性，且抗菌活性較強。LL-37為宿主天然免疫系統(tǒng)產生的小分子多肽，廣泛分布于人體，具有較高的生物安全性[21-22]。與傳統(tǒng)抗生素不同，LL-37主要通過破壞細菌細胞膜使細胞內容物外溢發(fā)揮抗菌活性，這一抗菌機制使其不僅不易導致耐藥菌株的出現，對大部分耐藥菌株也具有較強的抗菌作用[3-4，22-23]。

比較C16LL-37與LL-37的抗菌活性可以發(fā)現，C16LL-37抗菌活性較LL-37減弱，但相對其他4種標準菌，C16LL-37對變異鏈球菌的抗菌活性最強，且隨濃度增高，抗菌效果增強，作用持續(xù)時間延長。由此可見，C16LL-37對變異鏈球菌具備靶向特異性。然而，LL-37為α-螺旋結構抗菌肽，抗菌活性主要依賴α-螺旋結構的維持[24-25]。LL-37與CSPC16重組后，α-螺旋結構受到一定程度破壞，導致C16LL-37的抗菌活性較LL-37略減弱。

C16LL-37靶向特異性的發(fā)揮通過靶向定位區(qū)域（CSPC16）靶向誘導抗菌肽到達變異鏈球菌表面并與其表面受體特異性結合，使細菌細胞表面抗菌肽濃度短時間內急劇上升實現的。為進一步觀察C16LL-37的抗菌機制，通過SEM對經C16LL-37處理后的變異鏈球菌進行觀察，發(fā)現部分細菌形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，細胞膜破壞，可見細胞被碎屑包繞；由于抗菌肽濃度較低（32 μmol·L-1），仍可見部分形態(tài)正常的變異鏈球菌。這證實C16LL-37主要通過破壞細菌細胞膜使細胞內容物外溢導致細菌裂解死亡。這一抗菌機制同樣賦予了C16LL-37不易產生耐藥性的特點，有望解決臨床上化學合成抗生素導致的耐藥菌株增多等問題。

此外，通過比較不同濃度C16LL-37與LL-37的紅細胞溶血率發(fā)現，有效濃度的C16LL-37與LL-37溶血率甚小[26]，即便在高濃度條件下，二者溶血率仍低于30%。這表明C16LL-37具有較高的生物安全性，為其日后投入臨床應用提供了保障。

口腔有著復雜的理化環(huán)境?？谇蛔陨淼臏囟?、濕度、酸堿度等維持著口腔生境，還可以通過食物刺激分泌唾液間接地改變口腔環(huán)境[27-28]。本研究將C16LL-37（64 μmol·L-1）分別經不同溫度、pH值、不同濃度的鹽以及胰蛋白酶處理后作用于變異鏈球菌，檢測C16LL-37的抗菌活性，以對其穩(wěn)定性進行分析，結果發(fā)現，除了極高濃度的胰蛋白酶會導致C16LL-37的抗菌活性降低外，在不同的溫度、pH值、鹽濃度等條件下，C16LL-37具備較高的穩(wěn)定性，可充分發(fā)揮抗菌作用。

值得注意的是，本研究所選用天然抗菌肽LL-37全部（37個）的氨基酸作為抗菌區(qū)域，導致重組抗菌肽氨基酸數目多，相對分子質量大，結構不穩(wěn)定，合成、分離及純化過程費時、費力。因此，多肽合成前應對LL-37進行構效分析，以確定其氨基酸序列的主要功能區(qū)域，在保證具備較強抗菌活性的基礎上盡量減少氨基酸數目，使得STAMP的合成及處理過程高效快捷，結構更加穩(wěn)定。

綜上所述，人源特異性靶向抗菌肽C16LL-37具備抗菌譜窄、不易產生耐藥性、抗菌活性強、生物安全性高、穩(wěn)定性良好等比較優(yōu)越的生物學特性。因此，C16LL-37的成功合成為人類齲病防治及相關藥物的開發(fā)奠定了一定的基礎。

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（本文編輯吳愛華）

Biological characteristics of a human specifically targeted antimicrobial peptide C16LL-37 against Streptococcus mutans

Che Chunxiao1, Jiang Keyu1, Ma Yuanyuan1, Zeng Sa1, Zhou Jianye2, Li Zhiqiang2, He Xiangyi1.(1.School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;2.Key Laboratory of Oral Diseases of Gansu Province, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

[Key words]Streptococcus mutans;competence stimulating peptide;antimicrobial peptide;specifically targeted antimicrobial peptide

[Abstract]Objective This study aimed to evaluate the biological characteristics of a human specifically targeted antimicrobial peptide C16LL-37 against Streptococcus mutans (S.mutans).MethodsIn this study, an antimicrobial peptide LL-37, a peptide derived from CSPC16(S.mutans competence stimulating peptide), and recombinant peptide C16LL-37 were synthesized by Fmoc-chemistry-based strategy.The selectivity and antibacterial activity of C16LL-37 were identified by the colony counting method on microbial culture plates.After treatment of C16LL-37 at 32 μmol·L?1, the morphological changes in S.mutans were observed by using scanning electron microscopy (SEM).In addition, enzyme-linked immunosorbent assay was used to evaluate the hemolytic activity and antibacterial activity of C16LL-37 under different conditions.Results1) The minimum inhibitory concentration of C16LL-37 was 16 μmol·L?1, and the minimum bactericidal concentration was 64 μmol·L?1.2)The survival rate of S.mutans was 3.46% after C16LL-37 treatment at 64 μmol·L?1for 30 min, whereas it was 0% at 64 μmol·L?1for 60 min.The survival rates of four other kinds of bacteria were more than 60% at any time (P<0.05).3) The morphological change in S.mutans was observedafter C16LL-37 treatment at 32 μmol·L?1by using SEM.S.mutans presented an irregular shape, rough surface, and evident splitting.4) The hemolysis rate of C16LL-37 (≤64 μmol·L?1) was less than 0.33%.5) This study showed no significant influence on the antibacterial activity of C16LL-37 under different conditions, such as temperature, pH, salinity, and trypsin at low concentration (P>0.05).ConclusionC16LL-37 exhibited obvious specificity for S.mutans, strong antibacterial activity, low toxicity, and high stability.Thus, C16LL-37 has good potential in caries research and clinical application.

[中圖分類號]R 783

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.016

[收稿日期]2015-12-05； [修回日期]2016-03-02

[基金項目]國家自然科學基金地區(qū)科學基金（31160124/C0309）；甘肅省自然科學基金（1204FKCA16，1308RJZA248）

[作者簡介]車春曉，碩士，E-mail：chechx13@lzu.edu.cn

[通信作者]何祥一，教授，博士，E-mail：hexy@lzu.edu.cn