王飛　張慧宇　竇予昕　李適廷　張綱　譚穎徽第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科，重慶 400037

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降鈣素基因相關(guān)肽通過Hippo通路調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實驗研究

王飛張慧宇竇予昕李適廷張綱譚穎徽
第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科，重慶 400037

[摘要]目的前期研究發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性，為了進(jìn)一步揭示CGRP在骨修復(fù)中的作用，檢測CGRP對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化的影響，并對Hippo通路在這個過程中的作用進(jìn)行了初步探討。方法在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs中加入不同濃度的CGRP，處理48 h后測試堿性磷酸酶（ALP）活性，以篩選的優(yōu)勢濃度；處理7 d后進(jìn)行茜素紅染色，分別檢測細(xì)胞的分化情況。應(yīng)用Western blot檢測CGRP作用于BMSCs后，Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表達(dá)水平；利用Hippo通路抑制劑維替泊芬（Verteporfin）阻斷下游Yap信號，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測其對成骨相關(guān)因子Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）mRNA的表達(dá)影響。結(jié)果ALP活性檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，10-9、10-8、10-7mol·L-1濃度范圍的CGRP都能顯著促進(jìn)小鼠ALP活性的增加（P＜0.05），以10-8mol·L-1濃度的CGRP為最佳刺激濃度。用10-8mol·L-1濃度的CGRP處理后，茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。CGRP能夠顯著上調(diào)p-Mst1/2蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；當(dāng)運用了抑制劑Verteporfin時，顯著降低了CGRP誘導(dǎo)的Runx2、ColⅠ mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論CGRP能夠促進(jìn)小鼠BMSCs的成骨分化，且Hippo信號通路介導(dǎo)了CGRP作用于小鼠BMSCs成骨分化的過程。

[關(guān)鍵詞]降鈣素基因相關(guān)肽；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Hippo信號通路

Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81371110, 81300873).Correspondence: Tan Yinghui, E-mail: tanyhxqkq@163.com.

降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）在骨發(fā)育、骨代謝、骨修復(fù)以及種植體周圍的骨重建中都具有重要的病理生理學(xué)意義。本課題組在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，CGRP能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的人MG-63成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，并且探究了MG-63細(xì)胞蛋白質(zhì)組在CGRP參與的骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的變化[1-2]，這些結(jié)果更加明確了CGRP在骨修復(fù)中具有的重要意義。最近，一條在果蠅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新通路——Hippo信號通路，因其能夠級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)控制細(xì)胞的周期進(jìn)程、凋亡以及分化，是許多生理和病理過程的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)器而備受關(guān)注[3-5]。骨修復(fù)本身是一個復(fù)雜的生理過程，是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及信號之間的協(xié)同參與的緊密調(diào)控過程；在CGRP調(diào)控骨修復(fù)的過程中，Hippo信號通路是否涉及其中，尚未見相關(guān)報道。眾所周知，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）因具有取材方便、可塑性高、抗感染能力強等特點，在骨組織損傷修復(fù)中應(yīng)用前景十分廣闊[6-7]。為了進(jìn)一步揭示CGRP在骨修復(fù)中的作用，本研究檢測了CGRP對小鼠BMSCs成骨分化的影響，并初步探討了Hippo通路在CGRP的調(diào)控過程中所具有的作用。

1　材料和方法

1.1材料

小鼠BMSCs細(xì)胞系C3H10T1/2購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。CGRP、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松（Sigma公司，美國），p-Mst1/2抗體（CST公司，美國），Hippo通路抑制劑維替泊芬（Verteporfin）（Selleckchem公司，美國），胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美國），茜素紅染液、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所），總RNA提取試劑（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、實時定量熒光PCR試劑盒（Takara公司，日本），全波長多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)C3H10T1/2細(xì)胞常規(guī)用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)ALP活性檢測C3H10T1/2細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至對數(shù)生長期，分別加入0（空白對照組）、10-10、10-9、10-8、10-7mol·L-1的CGRP進(jìn)行處理，48 h后收集細(xì)胞裂解液，按試劑盒說明書進(jìn)行ALP活性測定。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3茜素紅染色C3H10T1/2細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后隨機分為空白對照組和實驗組?？瞻讓φ战M不加CGRP，實驗組加入等量含10-8mol·L-1CGRP的培養(yǎng)基，每孔2 mL，每3 d換液一次。7 d后棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，95%無水乙醇固定10 min，0.1%茜素紅-Tris-Hcl（pH= 8.3）溶液37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗3次，干燥，封片，鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)形態(tài)、數(shù)目。

1.2.4Western blot檢測p-Mst1/2蛋白表達(dá)為了明確CGRP誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程中是否涉及到Hippo信號通路，采用Western blot檢測Hippo通路核心分子Mst1/2磷酸化水平的變化。細(xì)胞以每孔1×106個的密度接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞貼壁，在培養(yǎng)基中加入CGRP作用24、48 h后提取細(xì)胞總蛋白并采用BCA法測樣品蛋白含量。倍比稀釋樣品，每孔上樣量為20 μL。聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠、5%濃縮膠），轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉。一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗4次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗4次，每次10 min。按照電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）超敏試劑說明書顯影，圖像分析。

1.2.5總RNA提取和熒光定量PCR檢測為了進(jìn)一步明確Hippo信號參與CGRP調(diào)控C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的方式，采用Hippo信號通路抑制劑Verteporfin 對C3H10T1/2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，并觀察抑制Hippo信號后，對CGRP作用于C3H10T1/2細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，ColⅠ）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （runt-related transcription factor 2，Runx2）mRNA表達(dá)所產(chǎn)生的影響。將C3H10T1/2細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，并隨機分為空白對照組和實驗組。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，空白對照組和實驗組均加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸、1×10-8mol·L-1地塞米松、10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液）。實驗組加或不加Hippo通路抑制劑Verteporfin，提前0.5 h對細(xì)胞行預(yù)處理。且實驗組中還加入10-8mol·L-1CGRP作用24 h和48 h，后收集細(xì)胞并用RNAiso Plus提取總RNA，按試劑盒說明書取1 μg RNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。所用引物由上海生工生物工程公司設(shè)計并合成。引物序列如下。ColⅠ上游引物序列：5’-TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA-3’，下游引物序列：5’-GGGTCCCTCGACTCCTACAT-3’；Runx2上游引物序列：5’-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3’，下游引物序列：5’-GGTGAAACTCTTGCCTCGTC-3’；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phos-phate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’，下游引物序列：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’。反應(yīng)結(jié)束后PCR儀自動生成熒光循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），用各組mRNA與內(nèi)參基因GAPDH的CT值差值（ΔCT）表示各組mRNA相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以上實驗均重復(fù)3次，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2　結(jié)果

2.1CGRP促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞分化的檢測結(jié)果

不同濃度CGRP作用C3H10T1/2細(xì)胞48 h后，0、10-10、10-9、10-8、10-7mol·L-1組ALP活性測量值分別為（190.342±7.406）、（223.475±9.911）、（407.289±11.069）、（835.770±38.464）、（436.674± 28.521） U·g prot-1。與空白對照組相比較，除了10-10mol·L-1組外，其余各組均能顯著促進(jìn)細(xì)胞的ALP活性（P＜0.05），并呈濃度依賴性，且10-8mol·L-1為最佳刺激濃度，這與本課題組前期篩選的濃度是一致的[8]。茜素紅染色的結(jié)果提示，與空白對照組相比，10-8mol·L-1CGRP處理后的C3H10T1/2細(xì)胞分泌形成鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目明顯增多（圖1）。

圖1　成骨分化能力檢測　茜素紅染色　× 100Fig 1　Ability of osteogenesis differentiation　alizarin red staining　× 100

2.2CGRP促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中p-Mst1/2的表達(dá)變化

采用Western blot檢測Hippo通路核心分子Mst1/2磷酸化水平的變化結(jié)果見圖2。在10-8mol·L-1的CGRP作用下，p-Mst1/2的表達(dá)相對于對照組都是明顯增高的（P＜0.05）。這說明在CGRP的作用下，Hippo信號產(chǎn)生了活化，這與前面的假設(shè)也是一致的。

圖2　CGRP對C3H10T1/2細(xì)胞p-Mst1/2表達(dá)的影響Fig 2　Effect of CGRP on p-Mst1/2 protein expression in C3H10T1/2 cells

2.3Verteporfin作用下CGRP誘導(dǎo)的ColⅠ、Runx2 mRNA 表達(dá)的改變

運用Verteporfin后，無論是24 h還是48 h，都能顯著降低CGRP誘導(dǎo)的ColⅠ、Runx2的表達(dá)（P＜0.01）（圖3）。提示Hippo信號在CGRP調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化中起一種正向調(diào)控作用。

圖3　Verteporfin對CGRP作用下ColⅠ和Runx2 mRNA表達(dá)的影響Fig 3　Influence of Verteporfin on CGRP-induced ColⅠand Runx2 mRNA expression

3　討論

BMSCs是中胚層來源的一種具有自我更新和多向分化能力的成體干細(xì)胞，具有強烈的成骨潛能，一直被認(rèn)為是骨組織工程的理想種子細(xì)胞[9-10]。將BMSCs與支架材料結(jié)合后移植到創(chuàng)傷部位是現(xiàn)今最好的局部骨缺損修復(fù)方法之一[11]。在骨折的自然愈合過程中，BMSCs能直接遷移至損傷部位增殖、分化成骨[12]。動物骨折的模型中，與正常野生型小鼠相比，糖尿病小鼠骨折愈合延遲，骨痂內(nèi)BMSCs數(shù)目顯著減少[13]。如何有效地募集BMSCs至修復(fù)區(qū)并促進(jìn)其增殖與分化，一直是骨修復(fù)中存在的難點。CGRP是一種主要由感覺神經(jīng)分泌的小分子神經(jīng)遞質(zhì)，因在臨床上顱腦損傷的骨折患者迅速的骨愈合現(xiàn)象中被重視。骨折發(fā)生時，在骨折局部以及患者血漿中CGRP含量均明顯升高[14-15]；提示這個小分子肽很可能參與了骨折修復(fù)的過程。體內(nèi)實驗證實，CGRP基因敲除的小鼠與野生型小鼠相比，會表現(xiàn)出更嚴(yán)重的骨缺失[16]。體外試驗也明確了CGRP能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖和分化[17]。作為骨修復(fù)最佳的種子細(xì)胞BMSCs，是否也能夠被CGRP作用并刺激其生物學(xué)活性？實際上有學(xué)者[18]通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)小鼠BMSCs表面存在著CGRP受體復(fù)合物：降鈣素受體樣受體（calcitonin receptor like receptor，CRLR）和受體活性修飾蛋白（receptor activity modifying protein，RAMP）。在本實驗中觀察了CGRP對BMSCs成骨分化的影響，結(jié)果顯示CGRP不僅能夠刺激成骨細(xì)胞的分化，也能夠促進(jìn)BMSCs的分化，且濃度為10-8mol·L-1時為最佳刺激濃度。最初關(guān)注到Hippo信號通路時，是因為其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。近年來，該通路在骨組織生長、代謝尤其是干細(xì)胞干性維持方面的作用越來越引起研究人員的注意[19-20]。在CGRP調(diào)控的成骨分化過程中，Hippo通路是否涉及其中，還不甚清楚。通過對Mstl/2磷酸化的檢測，能夠證實在CGRP作用于BMSCs過程中能夠上調(diào)p-Mstl/2的表達(dá)；更進(jìn)一步的檢測發(fā)現(xiàn)通過抑制劑Verteporfin的應(yīng)用，能夠明顯抑制CGRP誘導(dǎo)的ColⅠ、Runx2 mRNA的表達(dá)，說明CGRP通過Hippo信號作用于BMSCs細(xì)胞。這一結(jié)果對深入了解CGRP在成骨修復(fù)的過程中所具有的作用做了有力的補充。

目前關(guān)于Hippo通路的研究日趨豐富。已知的Hippo信號核心分子包括Mst1/2、Sav1、Lats1/2和Mob1，效應(yīng)分子包括Yap和Taz。其中，激酶Mstl/2在人體組織中分布廣泛，并且可通過磷酸化調(diào)控其余的3種核心蛋白，實際上Mstl/2的磷酸化可以被認(rèn)為是該通路激活的重要指標(biāo)[21]，這也是在本實驗中著重檢測p-Mstl/2的原因。Hippo通路的激活方式有2種，一種是刺激信號磷酸化活化Mst1/2，并經(jīng)過一系列的級聯(lián)磷酸化反應(yīng)后最終磷酸化Yap，使其產(chǎn)生一個14-3-3蛋白結(jié)合位點，與14-3-3蛋白的結(jié)合促使Yap滯留在細(xì)胞質(zhì)而失去轉(zhuǎn)錄激活功能。另一種是非磷酸化依賴途徑，即Yap自身特異性WW結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合Mst1/2、Lats1/2等上游信號分子的PPXY模序，進(jìn)而抑制Yap的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。

目前為止，Hippo通路在調(diào)控BMSCs分化中的研究僅限于Yap/Taz，該通路中其他信號分子的作用尚未見報道。本研究從Hippo通路的核心分子Mstl/2著眼，發(fā)現(xiàn)在CGRP促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化的過程中，激酶Mstl/2的磷酸化水平上升，證實了該通路的激活。

本研究主要從功能上揭示了Hippo信號通路參與了CGRP促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化。但對于Hippo通路與CGRP通過何種分子機制實現(xiàn)此調(diào)控還需深入研究。更進(jìn)一步的研究還在繼續(xù)，以期為CGRP的轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯杜冰）

Calcitonin gene-related peptide-induced osteogenic differentiation of mouse bone marrow stromal cells through Hippo pathway in vitro

Wang Fei, Zhang Huiyu, Dou Yuxin, Li Shiting, Zhang Gang, Tan Yinghui.(Dept.of Stomatology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)

[Key words]calcitonin gene-related peptide;bone marrow stromal cells;Hippo signaling pathway

[Abstract]Objective Previous studies have clarified that calcitonin gene-related peptide (CGRP) can promote the biological activity of osteoblasts.To further reveal the role of CGRP in bone repair, we studied its influence on osteogenic differentiation of mouse bone marrow stromal cells (BMSCs) and initially explored the effect of the Hippo signaling pathway with this process.MethodsBMSCs were induced to osteogenic differentiate osteoblasts by different concentrations of CGRP for a screening of the optimal concentration.CGRP was added in BMSCs, then the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the number of mineralized nodules were examined by specific ALP kits after 48 hours and alizarin red staining fluid after 7 days, respectively.The protein expression of p-Mst1/2 was measured by Western blot.Verteporfin was used to block the downstream Yap signaling.The mRNA expression of collagen typeⅠ(ColⅠ) and runt-related transcription factor 2 (Runx2) were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction.ResultsCompared to the blank group, different concentrations of CGRP (10?9, 10-8, 10?7mol·L-1), especially 10?8mol·L-1, significantly increased the ALP activity of BMSCs (P<0.05).Alizarin red staining also showed more mineralized nodules in 10?8mol·L-1group.The expression of p-Mst1/2 increased in the CGRP group (P<0.05).Verteporfin treatment effectively decreased the mRNA expression of Runx2 and ColⅠ(P<0.05).ConclusionTheHippo signaling pathway plays a role in CGRP-induced osteogenic differentiation in mouse BMSCs.

[中圖分類號]Q 254

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.014

[收稿日期]2015-12-15； [修回日期]2016-03-05

[基金項目]國家自然科學(xué)基金（81371110，81300873）

[作者簡介]王飛，碩士，E-mail：374346301@qq.com

[通信作者]譚穎徽，教授，博士，E-mail：tanyhxqkq@163.com