趙　珊，俞　娟，張　虹

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，昆明 650032)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并冠狀動(dòng)脈性心臟病患者Th1/Th2失衡的研究

趙珊，俞娟，張虹△

(云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，昆明 650032)

[摘要]目的探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)合并冠狀動(dòng)脈性心臟病(簡稱冠心病)患者的Th1/Th2是否存在失衡狀況。方法收集SLE患者(SLE組)、SLE合并冠心病患者(合并組)及健康對照者(對照組)外周血，real-time PCR法檢測外周血Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1/Th2細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及IL-4水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測患者外周血清中IFN-γ及IL-4水平并與對照組比較。結(jié)果SLE組患者外周血Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)水平、CD4+ T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ分泌水平及血清IFN-γ水平均明顯低于對照組(P<0.05)。合并組患者外周血Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)水平、CD4+ T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ分泌水平及血清IFN-γ水平均明顯高于SLE組患者及對照組(P<0.05)；合并組患者外周血Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)水平、CD4+ T細(xì)胞胞內(nèi)IL-4分泌水平及血清IL-4水平均明顯低于SLE組患者及對照組(P<0.05)。結(jié)論SLE合并冠心病患者存在Th1優(yōu)勢活化的Th1/Th2失衡狀態(tài)，這種失衡狀態(tài)可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；冠心??；T淋巴細(xì)胞，輔助誘導(dǎo)；Th1；Th2

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種自身免疫疾病，可累及心肌、心包及冠狀動(dòng)脈，是冠狀動(dòng)脈性心臟病(簡稱冠心病)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可加速冠心病的進(jìn)程，是影響冠心病患者預(yù)后的重要因素之一[1-3]。Th1、Th2是輔助性CD4+T細(xì)胞重要的亞群，健康人Th1、Th2保持著一種平衡狀態(tài)，Th1/Th2失衡與多種疾病相關(guān)，如感染[4]、腫瘤[5]、自身免疫疾病[6]等。近年來有研究表明Th1/Th2失衡參與冠心病的發(fā)生發(fā)展[7]。本文通過多種方法測定SLE合并冠心病患者體內(nèi)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子，以期明確Th1/Th2平衡紊亂在SLE合并冠心病發(fā)病中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2010年10月至2014年12月在本院住院的SLE合并冠心病患者40例(合并組)，其中，男16例，女24例，平均年齡(52.32±7.86)歲；未合并冠心病的SLE患者40例(SLE組)，其中，男14例，女26例，平均年齡(51.18±6.91)歲；健康對照者40例(對照組)，其中，男16例，女24例，平均年齡(53.27±7.74)歲。所有SLE患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，所有SLE合并冠心病患者需滿足以下條件：(1)心絞痛、心肌梗死典型的臨床癥狀、心電圖改變及心肌酶學(xué)的酶譜變化；(2)冠心病發(fā)作史；(3)冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CT血管成像證實(shí)存在冠狀動(dòng)脈狹窄，并伴隨心肌缺血癥狀。未合并冠心病的SLE患者排除以上冠心病癥狀或病史，健康對照者采用同期來醫(yī)院體檢的健康成人，排除肝、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，各項(xiàng)體檢指標(biāo)正常。

1.2血樣本采集及分離無菌采集抗凝靜脈血15 mL及促凝血3 mL，促凝血室溫放置30 min后離心收集血清并于-80 ℃冰箱凍存；抗凝血加等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，緩慢疊加至淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(Sigma公司)上，2 000 r/min離心20 min，收集中間白色細(xì)胞層。PBS液重復(fù)洗滌3次，離心收集單個(gè)核細(xì)胞，混懸于含1%雙抗(Invitrogen公司)和10% FBS(Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Invitrogen公司)中備用。

1.3real-time PCR檢測Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子取1×106單個(gè)核細(xì)胞溶解于1 mL Trizol(Invitrogen公司)中，采用酚-氯仿法抽提RNA，以O(shè)ligo-dT引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR采用SYBR Green PCR Mastermix試劑盒(ABI公司)，參照參考說明書進(jìn)行。其中，擴(kuò)增Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA的引物為，上游5′-CAA GCA GGG ACG GCG GAT GT-3′和下游5′-TTG GAC GCC CCC TTG TTG TTT G-3′;擴(kuò)增Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA的引物為，上游5′-GTG CCC GAG TAC AGC TCC GGA-3′和下游5′-GAG CCC ACA GGC ATT GCA GAC A-3′。所以，PCR反應(yīng)在ABI 7300儀器上進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)水平以T-bet或GATA-3與內(nèi)參基因β-actin的比值表示。

1.4流式細(xì)胞法檢測CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及IL-4的分泌水平取1×106單個(gè)核細(xì)胞懸于1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入PMA(終濃度0.1 mg/mL，Sigma公司)、Ionomycin(終濃度1 mg/mL，Sigma公司)及Golgistop(2 μL，BD公司)，混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。收集細(xì)胞，PBS液洗滌1遍，加抗CD3-Percp、抗CD4-APC各1 μL，常溫孵育30 min；PBS液洗滌2遍后加破膜液(BD公司)常溫孵育20 min；PBS液洗滌2遍后加抗IFN-γ-FITC、抗IL-4-PE各1 μL，常孵育40 min；洗滌2遍后加PBS液200 μL上流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測。

1.5ELISA法檢測血清中IFN-γ及IL-4的水平人IFN-γ及IL-4 ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本做2個(gè)復(fù)孔。

2結(jié)果

2.1各組患者外周血Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子比較real-time PCR檢測Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)果見圖1，SLE組患者Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.36)；合并組患者T-bet表達(dá)水平明顯高于SLE組患者及對照組(P<0.01)，而GATA-3的表達(dá)水平明顯低于SLE組患者及對照組(P<0.01)。

a:P<0.05，b:P<0.01。

圖1real-time PCR檢測各組患者Th1/Th2

細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3的表達(dá)

2.2各組患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子分泌能力比較流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ及IL-4分泌水平，見圖2～3。SLE組患者Th1細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平明顯低于對照組(P<0.05)，Th2細(xì)胞因子IL-4分泌水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.54)；合并組患者IFN-γ分泌水平明顯高于SLE組患者及對照組(P<0.05)，而IL-4的分泌水平明顯低于SLE組患者及對照組(P<0.01)。

a:P<0.05，b:P<0.01。

圖3流式細(xì)胞儀檢測各組患者CD4+T

細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及IL-4水平

2.3各組患者外周血IFN-γ及IL-4水平比較ELISA法檢測外周血IFN-γ及IL-4水平，結(jié)果見表1。SLE組患者血清IFN-γ的水平明顯低于對照組(P<0.01)，IL-4的水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.214)；合并組患者血清IFN-γ的水平明顯高于SLE組患者及對照組(P<0.01)，而IL-4的水平明顯低于SLE組患者及對照組(P<0.01)。

表1　ELISA法檢測各組患者外周血IFN-γ

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，SLE組比較。

3討論

Th1、Th2細(xì)胞是輔助性CD4+T細(xì)胞(Th細(xì)胞)的兩個(gè)重要亞群，Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-12、TNF-α等，輔助細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等，輔助體液免疫反應(yīng)。SLE的發(fā)病與Th1/Th2失衡有密切關(guān)系，盡管沒有統(tǒng)一的結(jié)論，大多學(xué)者認(rèn)為SLE患者Th1/Th2失衡表現(xiàn)為Th1細(xì)胞受抑制而Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)的狀態(tài)[9]，進(jìn)而過度激活B細(xì)胞，產(chǎn)生大量自身抗體造成免疫損傷。本研究中未合并冠心病的SLE患者與對照組比較，Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，且Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ的能力及血清中IFN-γ的水平均明顯降低，說明SLE患者的Th1反應(yīng)受到抑制，與文獻(xiàn)結(jié)果[8]一致。

SLE常累及心血管系統(tǒng)，冠心病是SLE較常見的一種并發(fā)癥。動(dòng)脈粥樣硬化及粥樣斑塊的形成和破裂是冠心病的病理基礎(chǔ)[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞因子IFN-γ參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[11]：IFN-γ一方面通過招募巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，介導(dǎo)病變處血管的炎性反應(yīng)；另一方面粥樣斑塊處的巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)IFN-γ受體的大量表達(dá)，說明IFN-γ可直接作用于粥樣斑塊的形成細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)SLE合并冠心病患者的Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子明顯上調(diào)，而Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子明顯下調(diào)，且患者CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力及外周血IFN-γ水平均呈現(xiàn)上升狀態(tài)，而Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及Th2細(xì)胞因子IL-4均被下調(diào)，說明SLE合并冠心病患者存在偏向Th1細(xì)胞反應(yīng)的失衡，Th1細(xì)胞的增多及Th1細(xì)胞因子IFN-γ的過多分泌是SLE合并冠心病的重要發(fā)病機(jī)制之一。

本研究的一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)是未合并冠心病的SLE患者Th1細(xì)胞反應(yīng)受抑制，而SLE合并冠心病患者的Th1反應(yīng)亢進(jìn)。這種看似矛盾的結(jié)果恰恰說明了SLE及其并發(fā)癥在發(fā)病機(jī)制上的復(fù)雜性[12-14]。韓鋒等[15]發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎患者外周血Th1細(xì)胞上調(diào)，且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。這些研究說明盡管未合并冠心病的SLE呈現(xiàn)Th1抑制的失衡反應(yīng)，但隨著患者發(fā)生各種各樣的并發(fā)癥，其Th1/Th2平衡會(huì)隨之發(fā)生變化，呈現(xiàn)出與未合并冠心病的SLE不同，而與并發(fā)癥相一致的Th1/Th2失衡狀態(tài)。這一方面解釋了諸多SLE患者Th1/Th2失衡研究中的不一致現(xiàn)象，可能是選取的患者發(fā)生的并發(fā)癥不一致導(dǎo)致的；另外也提示廣大研究人員，SLE患者的Th1/Th2失衡現(xiàn)象是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，處于疾病不同階段或伴隨著不同并發(fā)癥的SLE患者，其免疫紊亂機(jī)制可能不同，需仔細(xì)分類后再作分析。

綜上所述，本研究通過綜合研究Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，Th1/Th2細(xì)胞分泌因子及血清細(xì)胞因子水平探討未合并冠心病的SLE及SLE合并冠心病患者的Th1/Th2失衡狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)SLE合并冠心病患者呈現(xiàn)Th1反應(yīng)亢進(jìn)，Th2受抑制的現(xiàn)象，提示亢進(jìn)的Th1反應(yīng)可能是SLE患者并發(fā)冠心病的重要機(jī)制之一。

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Imbalance of Th1/Th2 in patients with systemic lupus erythematosus combined with coronary heart disease

ZhaoShan,YuJuan,ZhangHong△

(DepartmentofRheumatology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650032,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the imbalance of Th1/Th2 cell response in patients with systemic lupus erythematosus(SLE) combined with coronary heart disease.MethodsSLE patients,SLE patients with coronary heart disease and healthy controls were enrolled and blood samples were collected.T-bet/GATA-3,the transcription factors of Th1/Th2 cells,were detected by real-time PCR;the intracellular cytokines IFN-γ and IL-4 in CD4+ T cells were stained by fluorescent antibodies and detected by flow cytometry;the level of serum IFN-γ and IL-4 were detected by ELISA.ResultsComparing with healthy control group,the expression level of Th1 transcription factor T-bet,the introcellular secretion of IFN-γ in CD4+ T cells and the serum IFN-γ were all decreased in non-coronary heart disease patients with SLE(P<0.05).Comparing with non-coronary heart disease patients with SLE or healthy control group，the expression level of Th1 transcription factor T-bet,the introcellular secretion of IFN-γ in CD4+ T cells and the serum IFN-γ were all increased in patients with SLE combined coronary heart disease(P<0.05);while the expression level of Th2 transcription factor GATA-3,the introcellular secretion of IL-4 in CD4+ T cells and the serum IL-4 were all decreased in patients with SLE combined coronary heart disease(P<0.05).ConclusionThere were imbalance towards Th1 cell response in patients with SLE combined coronary heart disease,which may related to the occurrence and development of disease.

[Key words]erythematosus，systemic;coronary disease;T-lymphocytes,helper-inducer;Th1;Th2

作者簡介：趙珊(1972-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事結(jié)締組織病合并肺間質(zhì)纖維化、肺動(dòng)脈高壓、感染、冠心病的臨床診斷與治療研究。 △通訊作者,E-mail：0428zhanghong@sina.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.022

[中圖分類號]R392

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)02-0216-03

(收稿日期：2015-08-24修回日期：2015-09-22)