齊青松++++++劉志華+++徐建明++++++鐘培星++++++章小東

[摘要] 目的 分析HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞CD28表達特點。 方法 采集健康人、HBeAg陽性乙肝病毒攜帶者、HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的外周血，抗體標記，采用流式細胞技術(shù)檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T淋巴細胞，同時檢測肝功能、HBVDNA。 結(jié)果 慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞、CD28+T細胞明顯低于健康對照組（P<0.05）；高病毒載量組（HBVDNA≥107組）CD8+CD28+T細胞低于低病毒載量組（HBVDNA<107組）（P<0.05）。結(jié)論 所有結(jié)果顯示乙型肝炎病毒持續(xù)感染狀態(tài)與CD8+T細胞上共刺激分子CD28的表達低下有關(guān)， 而CD8+T細胞上CD28的低表達與高病毒載量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎；T淋巴細胞；CD28

[中圖分類號] R512.6+2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）09-0018-04

HBV感染后的轉(zhuǎn)歸依賴于人體免疫狀態(tài)及其免疫應答，強有力的免疫反應針對病毒多種抗原產(chǎn)生特異性抗體最終清除病毒，而低下的免疫反應不僅不能控制病毒復制而且導致持續(xù)感染和疾病進展。CD8+T細胞作為主要效應細胞，在病毒清除中起重要作用[1，2]。而T細胞正常激活需要共刺激信號，CD28是T細胞上重要的共刺激分子，CD28對T細胞活化起關(guān)鍵作用[3]。盡管多種治療的實施包括抗病毒藥物的應用，最終能夠清除病毒的慢性乙型肝炎病例較少，因此筆者分析慢性乙型肝炎患者外周血CD28分子在T淋巴細胞表達情況、并將乙肝感染者與健康人群比較、探討乙肝感染慢性化的原因。

1 對象與方法

1.1研究對象

研究對象來自2012年7月～2013年8月廣東醫(yī)學院附屬東莞市厚街醫(yī)院傳染科門診及住院病區(qū)患者以及本院職工，從符合抗病毒標準[4]的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中，知情同意后，抽取22例患者準備接受抗病毒治療為A組，其中男13例，女9例，年齡21～45歲，平均（29.59±7.35）歲；另抽取21例HBeAg陽性慢性乙肝病毒攜帶者為B組，其中男13例，女8例，年齡20～45歲，平均（31.33±7.81）歲；本院HBsAg陰性的健康職工中抽取20例為C組，其中男12例，女8例，年齡21～42歲，平均（31.15±5.04）歲。排除標準：①6個月內(nèi)使用過抗乙肝病毒、免疫抑制劑等藥物；②同時感染甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、HIV；③伴有其他系統(tǒng)嚴重疾?。◥盒阅[瘤、嚴重心臟病、糖尿病等）或免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑儀器 Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE購自美國ebioscience公司，BD-FACSCalibur II流式細胞分析儀。

1.2.2 細胞染色流式細胞儀檢測分析 EDTA抗凝管抽取靜脈3 mL，1500 rpm/min離心5 min后，3 mLD-Hanks液小心稀釋沉淀，再次1500 rpm/min離心20 min后，小心將白膜層細胞吸出。D-Hanks液洗滌一次后，加入Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE抗體室溫避光染色30min，然后2%小牛血清PBS洗滌2次后，BD-FACSCaliburⅡ流式細胞分析儀進行檢測并進行結(jié)果分析。

1.2.3 HBVDNA、肝功能、乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測 HBV-DNA定量檢測采用ABI7000檢測儀，乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測采用ELISA方法進行，肝功能使用貝克曼DXC800自動化分析儀。

1.3統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組標準化的樣本數(shù)值用（x±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

所有檢測數(shù)值為各T細胞亞群占CD3+T細胞百分比計算，CD3+T細胞代表總T淋巴細胞。

2.1 三組T細胞亞群比較

將A組（慢性乙型肝炎組）、B組（乙肝病毒攜帶組）、C組（健康對照組）年齡進行比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2相關(guān)指標比較

A組、B組CD4+T細胞百分率、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值低于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），A組、B組CD8+T細胞百分率高于健康對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；見表1。A組、B組CD28+T細胞、CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率低于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而A組、B組之間CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 不同病毒載量患者T細胞亞群比較

筆者按病毒載量HBVDNA≥107、HBVDNA<107分組比較，高拷貝組CD4+CD28+T細胞百分率低于低拷貝組，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高拷貝組CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率低于低拷貝組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 慢乙肝病人及健康人外周血T淋巴細胞亞群上CP28分子表達

以單個慢性乙型肝炎病人、乙肝攜帶者、健康人為例，采用流式細胞儀分析外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞亞群以及各亞群CD28分子表達情況。見圖1～3。

3 討論

乙肝病毒感染發(fā)病與清除機制尚未完全弄清，普遍認為與感染者免疫狀態(tài)有關(guān)，CD4+T細胞為輔助性T細胞，CD8+T細胞是清除病原體的主要效應細胞，其中CTL（cytotoxix T lymphocyte，細胞毒性T淋巴細胞）在控制感染及清除病原體過程中起著關(guān)鍵作用[5、6]，CD8+CD28+T細胞就是CTL。

T細胞功能正常是以活化為前提的，它的激活必須經(jīng)過雙信號， 第一信號通過T細胞抗原受體識別并結(jié)合抗原遞呈細胞表面的MHC（major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體）-抗原肽產(chǎn)生，第二信號通過T細胞上CD28與抗原遞呈細胞上的B7分子結(jié)合產(chǎn)生[7]。近10余年，許多新的共刺激通路和共刺激分子被發(fā)現(xiàn)，雙信號理論也得到不斷完善，傳統(tǒng)的CD28/B7通路仍然是最主要的共刺激通路，因此筆者對慢性乙型肝炎患者外周血T細胞上CD28表達情況進行研究。

本研究選取22例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者和21例乙肝病毒攜帶者，并選擇20例本院健康職工為對照組，由于CD28表達隨著年齡的增長而逐步下調(diào)[8]，筆者對三組年齡進行比較，差異無統(tǒng)計學意義，因而具有可比性。研究結(jié)果顯示：①慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義，與Arasli[9]、范振平[10]報道一致。有研究表明，CD4+T細胞對CD8+T細胞的增殖與活化具有重要調(diào)節(jié)作用[11]，CD4+T細胞自身同樣需要活化，CD4+CD28+T細胞減少表明能被活化的CD4+T細胞減少，因而CD4+T細胞的調(diào)節(jié)作用受影響，必然在一定程度上影響到CD8+T細胞的增殖與活化。②慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD8+CD28+T細胞低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義，與范振平[10]、王沂芹[12]報道結(jié)果一致。因此，以上結(jié)果表明乙肝感染者CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞減少與乙肝感染持續(xù)狀態(tài)有相關(guān)性。③慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞之間差異無統(tǒng)計學意義。理論上，慢性乙型肝炎處于免疫激活狀態(tài)，乙肝病毒攜處于免疫耐受狀態(tài)，他們之間應該存在差異，本研究結(jié)果可能與樣本含量有關(guān)，需要擴大樣本量。不過，無論是慢性肝炎還是乙肝病毒攜帶者，最終能清除病毒的比例極少，顯示兩者免疫狀態(tài)沒有本質(zhì)上的區(qū)別，可能是免疫耐受程度稍有差異。

另外，筆者將研究對象按照病毒載量高低分為HBVDNA≥107、HBVDNA<107兩組，結(jié)果病毒載量越高，CD8+CD28+T細胞百分率越低，而CD4+CD28+T細胞百分率并不受HBV病毒載量的影響，提示HBV高復制與CD8+T細胞的CD28分子的低表達有相關(guān)性。不過，并非只有HBV感染出現(xiàn)CD8+T細胞上CD28分子的表達低下，HIV、EBV等病毒[13、14]也出現(xiàn)同樣表現(xiàn)，結(jié)合目前實驗結(jié)果，筆者推測，HBV特異性CTL長期暴露在大量抗原刺激，可能導致CD8+CD28+T細胞消耗性減少，因而表現(xiàn)為乙肝感染者CD8+T細胞上CD28分子的表達下調(diào)。但是，最近有研究發(fā)現(xiàn)[15]慢性乙型肝炎患者外周血游離CD28較健康人增多，結(jié)合慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T細胞減少這一現(xiàn)象是否暗示著：CD8+CD28+T細胞減少另外一個原因可能是CD8+CD28+T細胞上CD28+分子與之解離導致？這還需要進一步論證。

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（收稿日期：2013-12-09）

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（收稿日期：2013-12-09）