張小薇++++++任建敏++++++傅麗敏++++++周靈玲

[摘要] 目的 分析兒童急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化及調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法 在2016年2月23日～2017年2月23日期間選取50例健康體檢者（對(duì)照組）、50例急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒（觀察組）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)兩組受檢者均進(jìn)行分離外周血CD4+T細(xì)胞、熒光定量PCR（RT-PCR、REAL-TIME PCR、總RNA定量和提取、RT-PCR產(chǎn)物鑒定）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，隨后對(duì)比兩組受檢者各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果 觀察組患兒的CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）、TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）、Mtge-β（58.44±10.85）、IL-35p35（326.84±35.46）、IL-35EB13（128.56±12.74）、TGF-β（81.46±5.43）、IL-10（135.75±12.75）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%、 Foxp3（812.43±56.32）、CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）%均高于對(duì)照組健康體檢者的CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）、TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）、Mtge-β（23.17±5.33）、IL-35p35（154.28±26.31）、IL-35EB13（48.31±6.52）、TGF-β（29.51±6.38）、IL-10（24.91±5.22）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%、 Foxp3（322.41±18.75）、CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）%（P<0.05）。 結(jié)論 導(dǎo)致急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒出現(xiàn)亞群比例失調(diào)的主要原因?yàn)檗D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、分化群28（Cluster of Differentiation 28）、ICOS過度活化。

[關(guān)鍵詞] 急性B淋巴細(xì)胞白血?。籘淋巴細(xì)胞；調(diào)節(jié)機(jī)制；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）31-0005-04

[Abstract] Objective To analyze the changes and regulatory mechanism of regulatory T lymphocytes in children with acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）. Methods A total of 50 children of healthy subjects （control group） and 50 children with acute B lymphocytic leukemia （observation group） who were selected from February 23rd， 2016 to February 23rd， 2017 were selected as the study subjects. CD4+ T cells were isolated from peripheral blood in both groups， and quantitative PCR（RT-PCR， REAL-TIME PCR， total RNA quantification and extraction， RT-PCR product identification）， enzyme-linked immunosorbent assay， and flow cytometry were carried out， and then the results of each test were compared between the two groups. Results CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）， TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）， Mtge-β （58.44±10.85）， IL-35p35 （326.84±35.46）， IL-35EB13（128.56±12.74）， TGF-β（81.46±5.43）， IL-10（135.75±12.75）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%， Foxp3（812.43±56.32）， CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）% in the observation group were all higher than CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）， TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）， Mtge-β（23.17±5.33）， IL-35p35（154.28±26.31）， IL-35EB13（48.31±6.52）， TGF-β （29.51±6.38）， IL-10 （24.91±5.22）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%， Foxp3（322.41±18.75）， CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）% in the healthy subjects in the control group（P<0.05）. Conclusion The main reason for subgroup ratio imbalance in children with acute B lymphocytic leukemia is the over-activation of transforming growth factor-β（TGF-β）， cluster of differentiation 28 and ICOS.endprint

[Key words] Acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）； T lymphocyte； Regulatory mechanism； Enzyme-linked immunosorbent assay

急性B淋巴細(xì)胞白血病屬于臨床常見疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確；隨著相關(guān)報(bào)道的增多，部分學(xué)者認(rèn)為其與免疫水平低下和白血病細(xì)胞惡性克隆有關(guān)，但具體的抗腫瘤免疫功能異常機(jī)制尚不明確[1-3]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞屬于細(xì)胞亞群，是一種具有調(diào)節(jié)、免疫功能的細(xì)胞，能夠參與細(xì)胞調(diào)節(jié)和抑制腫瘤[4]。隨著對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病的深入探索，可發(fā)現(xiàn)CD4+CD25high Foxp3細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞間接觸，促使腫瘤細(xì)胞活化、發(fā)育的抑制，控制腫瘤組織的生長(zhǎng)、發(fā)育[16]。根據(jù)腫瘤功能方式和表面標(biāo)記分值表達(dá)的差異，可將其分為ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+兩種完全不同的細(xì)胞亞群，其中前者主要依賴結(jié)合型接到細(xì)胞間接觸抑制，后者能夠發(fā)揮免疫抑制功能。而本文旨在探索急性B淋巴細(xì)胞白血病調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對(duì)象為2016年2月23日～2017年2月23日期間收治的50例急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒、50例健康體檢者，其中對(duì)照組為健康體檢者，觀察組為急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象患兒家長(zhǎng)均了解、知情、同意本次實(shí)驗(yàn)；（2）受檢者均能夠配合實(shí)驗(yàn)人員完成本次操作；（3）受檢者均無嚴(yán)重心功能、肝腎功能等實(shí)質(zhì)性臟器功能受損；（4）受檢者均能夠完成正常交流；（5）受檢者均無本次實(shí)驗(yàn)制劑過敏；（6）受檢者均無精神家族史[5]。觀察組平均體質(zhì)量（22.42±0.72）kg，平均年齡為（10.74±0.85）歲，男20例，女30例。對(duì)照組平均體質(zhì)量（22.51±0.79）kg，平均年齡為（10.33±0.71）歲，男21例，女29例。兩組受檢者基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

分離外周血CD4+ T細(xì)胞：抽取受檢者靜脈血3 mL后，進(jìn)行離心法分離（使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法），檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞，且使用美國INVITROGEN公司提供的試劑盒，檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞（實(shí)施免疫磁珠分離法），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度>97%；錐蟲藍(lán)染色判定細(xì)胞活力>95%[6-7]。

熒光定量PCR：（1）RT-PCR：選用立陶宛MBI公司提供的試劑盒，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA，且需其中1 μL作為模板，實(shí)施擴(kuò)大循環(huán)，再參照GENBANK中基因MRNA序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物；（2）總RNA定量和提?。哼x用美國AMBION公司提供的AM1912試劑盒，檢測(cè)外周細(xì)胞因子，且收集樣本后，進(jìn)行分離處理，再按照步驟進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定RNA含量；（3）REAL-TIME PCR：選用大連寶生物提供的SYBGREEN試劑盒，進(jìn)行熒光量測(cè)定，具體方式如試劑說明書；（4）RT-PCR產(chǎn)物鑒定：取10 μL β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物、Itch、TGF-β誘導(dǎo)早期基因1、SMAD4、SMAD3在2%瓊脂糖凝膠中，且進(jìn)行回收純化，進(jìn)行30 min的90 V電泳，并交由上海技術(shù)有限公司測(cè)定。將其結(jié)果與基因mRNA序列比較，Itch、TGF-β誘導(dǎo)早期基因1、β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物、SMAD4、SMAD3與GENBANK中目的基因序列完全一致[8-11]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：抽取兩組受檢者空腹外周靜脈血2 mL，且實(shí)施分離血清處理，離心操作維持10 min，每分鐘800 r速度進(jìn)行，將上層血漿分離后，可使用美國EBIOSCIENCE公司提供的BMS249/3型號(hào)的雙抗體夾心法檢測(cè)血漿中TGF-β濃度，具體方式如說明書。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：首先將CD4-EFLURO450設(shè)門使用全血直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)，且進(jìn)行破膜、固定處理，經(jīng)可誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激分值、CD25-PECy7、TGF-β-PE、Foxp3-APC等抗體染色30 min，再檢測(cè)CD4+ CD25high ICOS Foxp3+細(xì)胞比例和其表明膜結(jié)合型蛋白表達(dá)水平。同時(shí)另外抽取外周血1 mL，經(jīng)體外刺激，實(shí)施蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，且在5% CO2，37 ℃溫度下，孵育6 h后，再次檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)[12-13]。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比兩組受檢者的CD28/CD4+Foxp3+、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+、TGF-βRII/CD4+、Mtge-β、IL-35p35、IL-35EB13、TGF-β、IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3、 Foxp3、CD4+CD25high Foxp3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1兩組受檢者的各項(xiàng)檢查結(jié)果比較

分析表格，可發(fā)現(xiàn)觀察組患兒各項(xiàng)檢查結(jié)果均高于對(duì)照組健康體檢者（P<0.05），由此說明急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒可出現(xiàn)細(xì)胞異?；罨蛠喨罕壤д{(diào)，且與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化有關(guān)。見表1。

2.2兩組受檢者的炎性因子水平比較

觀察組IL-35p35、IL-35EB13、IL-10高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3兩組受檢者的Mtge-β、TGF-β比較

觀察組Mtge-β、TGF-β均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

急性B淋巴細(xì)胞白血病以幼稚、原始淋巴細(xì)胞亞型克隆為主，屬于臨床好發(fā)的惡性腫瘤，細(xì)胞可表現(xiàn)為廣泛性浸潤和大量繁殖，目前其腫瘤免疫發(fā)病機(jī)制和病因尚未明確，若干預(yù)不及時(shí)，可影響機(jī)體正常造血功能，促使病情惡化，甚至危及患兒生命安全，對(duì)此類患兒，治療的關(guān)鍵在于腫瘤細(xì)胞清除和免疫監(jiān)視過程[14-15]。endprint

隨著對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病的深入探索，可發(fā)現(xiàn)CD4+CD25high Foxp3細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞間接觸，促使腫瘤細(xì)胞活化、發(fā)育的抑制，控制腫瘤組織的生長(zhǎng)、發(fā)育[16]。根據(jù)腫瘤功能方式和表面標(biāo)記分值表達(dá)的差異，可將其分為ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+兩種完全不同的細(xì)胞亞群，其中前者主要依賴結(jié)合型接到細(xì)胞間接觸抑制，后者能夠發(fā)揮免疫抑制功能。在早期報(bào)道中，可發(fā)現(xiàn)血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤容易出現(xiàn)功能異?，F(xiàn)象，主要表現(xiàn)為腫瘤發(fā)生、發(fā)展與TREG細(xì)胞存在密切關(guān)系，而本次實(shí)驗(yàn)中，可發(fā)現(xiàn)患有急性B淋巴細(xì)胞疾病的兒童，外周血CD4+CD25high Foxp3明顯高于正常兒童，且水平值與機(jī)體免疫活性狀態(tài)呈正比，由此證實(shí)，此項(xiàng)指標(biāo)能夠反映機(jī)體活化狀態(tài)，而其升高的主要原因與腫瘤組織增大有關(guān)。隨著研究的進(jìn)一步探索[17-20]，可發(fā)現(xiàn)TREG細(xì)胞抑制功能狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)存在一定關(guān)系，當(dāng)兒童合并急性B淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，可發(fā)現(xiàn)ICOS+Foxp3抑制性細(xì)胞因子IL-35、IL-10和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)，能夠反映機(jī)體細(xì)胞亞群功能異常和過度活化，引起病情加重，而本次實(shí)驗(yàn)，也證實(shí)IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3均高于正常兒童。

誘導(dǎo)TREG細(xì)胞的分子機(jī)制尚未明確，而TREG細(xì)胞能夠促使轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，且在TREG功能維持、成熟、分化過程中發(fā)揮重要作用，被學(xué)者標(biāo)志為TREG的特異性標(biāo)志分子。當(dāng)初始CD4+T細(xì)胞表面受體TGT-βRI/II和TGF-β結(jié)合時(shí)，可觸發(fā)TIEGI和SMAD型號(hào)，前者能夠在ITCH的協(xié)助下，增強(qiáng)Foxp3的表達(dá)因子，后者能夠誘導(dǎo)Foxp3基因啟動(dòng)，同時(shí)初始去甲基化的表達(dá)，從而將CD4+T細(xì)胞分化為TREG細(xì)胞。而本次研究中，可發(fā)現(xiàn)急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒TGT-βRI/II、CD4+T細(xì)胞、TGF-β濃度以及ITCH表達(dá)均呈現(xiàn)為上升趨勢(shì)，其可能與患兒機(jī)體TGT-β信號(hào)過度活化或細(xì)胞數(shù)量異常有關(guān)，提示急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒的TREG細(xì)胞功能和數(shù)量。

除了TGT-β信號(hào)外，ICOS+Foxp3細(xì)胞亞群分化也存在不同調(diào)節(jié)機(jī)制，ICOS可誘導(dǎo)ICOS+Foxp3細(xì)胞活化、增殖，與細(xì)胞表面配體ICOS結(jié)合，促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，強(qiáng)烈誘導(dǎo)ICOS+Foxp3細(xì)胞活化，而分析本次實(shí)驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒存在CD28和ICOS表達(dá)增高，其提示著細(xì)胞亞群異?；罨瑫r(shí)機(jī)體內(nèi)多種亞群比例失調(diào)或細(xì)胞異?；罨c調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子信號(hào)有關(guān)，其中CD28、ICOS、TGT-β信號(hào)過度活化具有重要作用，但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索、研究。

總而言之，急性B淋巴細(xì)胞白血病患兒的亞群比例失調(diào)、細(xì)胞異?；罨c多種調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子信號(hào)有關(guān)，其中以TGF-β、CD28、ICOS過度活化最為常見，但由于本次實(shí)驗(yàn)樣本有限，因此其分子機(jī)制還有待探索。

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（收稿日期：2017-08-04）endprint