袁　芳

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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山楂葉總黃酮對H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響

袁芳

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的研究山楂葉總黃酮(HLF)對H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響。方法無菌環(huán)境下分離3日齡的SD乳鼠心肌細胞，培養(yǎng)72 h后分組進行干預(yù)：空白對照組、H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2干預(yù)組、舒血寧注射液100 μg/mL+H2O2干預(yù)組，每組設(shè)10個復(fù)孔。干預(yù)6 h后，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞存活率；應(yīng)用生化分析儀檢測培養(yǎng)液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量；應(yīng)用紫外可見分光光度計測定細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量；應(yīng)用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率；并應(yīng)用Western blot法檢測心肌細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達并進行半定量分析。結(jié)果與H2O2干預(yù)組比較，山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2干預(yù)組乳鼠心肌細胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，細胞存活率顯著升高，AST、CPK、LDH釋放量顯著降低，細胞中SOD、CAT活性顯著升高， MDA含量顯著降低，caspase-3表達量及細胞凋亡率顯著降低，并且山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2干預(yù)組GSH-Px活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論山楂葉總黃酮對H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡具有改善作用。

[關(guān)鍵詞]山楂葉總黃酮；H2O2；心肌細胞；氧化應(yīng)激；凋亡

山楂葉是我國傳統(tǒng)中藥，其主要有效成分為山楂葉總黃酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括蘆丁、槲皮素、金絲桃甙、牡荊素等成分[1]。閔清等[2]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮能夠有效改善機體抗氧化酶活性，提高自由基清除能力，從而表現(xiàn)出良好的抗氧化作用；毛曉霞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮具有抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡的作用，可調(diào)節(jié)血脂的生物學(xué)活性[4]。本實驗旨在觀察山楂葉總黃酮對H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1動物SPF級雄性SD 大鼠，3日齡，由河北省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2藥物與試劑山楂葉總黃酮(山西晉城中晉藥業(yè)有限公司，批號：20140819，總黃酮含量≥95%)；舒血寧注射劑(神威藥業(yè)有限公司，批號：Z1403028)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；甲基四唑藍(MTT)(美國Sigma公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)檢測試劑盒及AnnexinV/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；caspase-3單體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.3主要儀器超凈工作臺(江蘇蘇凈集團)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋集團和美國Thermoscientific公司)；-20 ℃冰箱(河南新飛電器公司)；超速低溫離心機(德國Kendro公司)；常溫離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標儀(美國 BIO-RAD公司)；UV-1800 PC型紫外可見分光光度計(廣州科曉科學(xué)儀器有限公司)；FACSAria流式細胞儀(美國BD公司)；DYY-11 型多用電泳儀和DYCZ-40B 轉(zhuǎn)印泳槽(北京六一儀器廠)。

1.4細胞的分離與培養(yǎng)參照李澎等[5]報道的方法分離并培養(yǎng)乳鼠心肌細胞：無菌條件下摘取乳鼠心臟并剪取同一部位心室組織，剪碎后加入0.1%胰酶，37 ℃振蕩消化5 min，去上清，取沉淀繼續(xù)用0.1%胰酶于37 ℃振蕩消化5 min，如此循環(huán)直至組織碎塊消化完畢，2 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入心肌細胞培養(yǎng)基，壁立1.5 h后收集未貼壁細胞，調(diào)整細胞至 6×108L-1，接種于培養(yǎng)器皿中，37 ℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)72 h后用于實驗。

1.5細胞分組與給藥取1.4處理后狀態(tài)良好的原代乳鼠心肌細胞，分為空白對照組、H2O2(100 μg/mL)干預(yù)組、山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組、舒血寧注射液100 μg/mL+H2O2組，每組設(shè)10個復(fù)孔，分別給予相應(yīng)藥物進行干預(yù)。

1.6觀察項目

1.6.1細胞形態(tài)觀察藥物干預(yù)6 h后，棄培養(yǎng)液，經(jīng)PBS溶液沖洗2次后，用去離子水洗劑，直至顯微鏡下細胞間隙清晰為止，晾干后于光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.6.2細胞存活率檢測給藥干預(yù)6 h后，通過MTT比色檢測細胞存活率：將心肌細胞接種于 96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)8個復(fù)孔，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min后通過酶標儀測定每組細胞于波長490 nm 處吸光度(OD)值，然后計算心肌細胞存活率。心肌細胞存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.6.3培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量的檢測干預(yù)6 h后，取細胞培養(yǎng)液，按照各試劑盒操作方法步驟，通過紫外可見分光光度計測定各組細胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量。

1.6.4細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量檢測干預(yù)6 h后，棄培養(yǎng)基并迅速刮取細胞，每孔加入2 mL PBS，冰浴中通過超聲細胞粉碎儀處理30 s后，3 500 r/min低溫(4 ℃)離心10 min，取上清液，然后嚴格按試劑盒步驟操作，通過紫外可見分光光度計測定各組細胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.6.5細胞凋亡的檢測干預(yù)6 h后，用0.25%胰酶消化，1 500 r/min離心5 min后棄上清液，PBS溶液潤洗2次，離心取細胞；按照細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況，最后在流式二維圖中計算凋亡率。

1.6.6細胞中caspase-3表達的檢測干預(yù)6 h后，經(jīng)PBS清洗3次，加入0.2 mL冷裂解緩沖液，超聲碎裂細胞。12 000 r/min低溫(4 ℃)離心20 min， 通過BCA法進行蛋白定量，蛋白變性后上樣，電泳，待溴酚藍接近膠底部時停止電泳；轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(caspase-3，β-actin)4 ℃過夜。洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實驗結(jié)果應(yīng)用 Quantity One 軟件進行分析。

2結(jié)果

2.1各組細胞形態(tài)表現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：空白對照組細胞形態(tài)未見異常，呈單層簇狀生長，偽足多而飽滿，搏動明顯、節(jié)律一致；而H2O2干預(yù)組細胞細胞形態(tài)明顯異常，偽足減少，大量心肌細胞脫落、溶解壞死，搏動減弱，頻率降低；各給藥組干預(yù)后細胞形態(tài)明顯改善，其中以山楂葉總黃酮200 μg/mL組效果最為顯著。見圖1～6。

圖1　空白對照組心肌細胞形態(tài)

2.2各組細胞存活率比較空白對照組細胞存活率為(96.3±5.4)%，H2O2干預(yù)組為(46.1±9.8)%，山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2組為(53.7±11.2)%，山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組為(67.4±10.5)%，山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組為(85.5±13.1)%，舒血寧注射液100 μg/mL+H2O2組為(76.9±12.0)%。H2O2干預(yù)組細胞存活率明顯低于空白對照組(P<0.05)；山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組和山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組心肌細胞存活率明顯高于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)。

圖2　H2O2干預(yù)組心肌細胞形態(tài)

圖3　山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2組心肌細胞形態(tài)

圖4　山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組心肌細胞形態(tài)

圖5　山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組心肌細胞形態(tài)

圖6　舒血寧注射液100 μg/mL+H2O2組心肌細胞形態(tài)

2.3各組細胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量比較H2O2干預(yù)組培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)；山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組和舒血寧注射液100 μg/mL + H2O2組培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量均明顯低于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組心肌細胞培養(yǎng)液中AST、CPK、

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與H2O2干預(yù)組比較，P<0.05。

2.4各組細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比較H2O2干預(yù)組細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性明顯低于空白對照組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.05)；山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組心肌細胞中SOD、CAT活性明顯高于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)，MDA含量明顯低于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)；山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組干預(yù)組GSH-Px活性和舒血寧注射液100 μg/mL + H2O2組SOD、MDA含量明顯高于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)。見表2。

2.5各組細胞凋亡率比較空白對照組、H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組、舒血寧注射液100 μg/mL + H2O2組細胞凋亡率分別為(4.9±0.7)%，(50.8±10.9)%，(44.6±8.3)%，(23.1±5.6)%，(17.5±4.2)%，(18.9±5.3)%。H2O2干預(yù)組細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)；山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組、舒血寧注射液100 μg/mL + H2O2組心肌細胞凋亡率均明顯低于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)。見圖7。

2.6各組細胞caspase-3表達情況通過Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，空白對照組、H2O2干預(yù)組、山楂葉總黃酮50 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組、舒血寧注射液100 μg/mL+H2O2組caspase-3表達量分別為1.0±0.1，2.1±0.3，1.9±0.2，1.6±0.2，1.3±0.1，1.4±0.2。H2O2干預(yù)組細胞中caspase-3表達量明顯高于空白對照組(P<0.05)；山楂葉總黃酮100 μg/mL+H2O2組、山楂葉總黃酮200 μg/mL+H2O2組、舒血寧注射液100 μg/mL + H2O2組心肌細胞中caspase-3表達量均明顯低于H2O2干預(yù)組(P均<0.05)。見圖8。

表2　各組細胞SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與H2O2干預(yù)組比較，P<0.05。

圖7　各組心肌細胞凋亡狀況

圖8　各組H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞caspase-3表達情況

3討論

急性心肌梗死是目前嚴重危害人類生命健康的主要疾病之一，通過溶栓以及介入手術(shù)等方法能夠及時恢復(fù)血流再灌注，但恢復(fù)血流供應(yīng)后，隨著氧的涌入，自由基大量生成與過剩而將誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，進而導(dǎo)致細胞凋亡[6-7]，往往最終導(dǎo)致組織損傷加重，此為“再灌注損傷”[8-9]重要的病理機制之一。

SOD被稱為體內(nèi)氧自由基的“清道夫”，能夠提供氫原子配體而催化還原氧自由基生成過氧化氫[10]，并且在GSH-Px和CAT催化作用下能夠被進一步還原生成對人體無害的水和氧[11]；不飽和脂肪酸為細胞膜主要組成部分，極易受氧自由基的攻擊發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成MDA，所以培養(yǎng)液中MDA含量能夠間接反映細胞膜氧化應(yīng)激損傷程度。生理狀態(tài)下，血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量非常低，但心肌細胞受損后，心肌酶迅速釋放入血導(dǎo)致血清中含量陡然增高，因此心肌酶學(xué)檢查是臨床上診斷心肌細胞損傷的重要技術(shù)手段[12]。

山楂葉總黃酮是指從山楂樹的葉子中提取的黃酮類化合物的總稱，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腦組織缺血等多種藥理學(xué)作用。本實驗通過分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞，設(shè)空白對照組和H2O2干預(yù)組作為對照研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮干預(yù)6 h能夠有效改善H2O2損傷乳鼠心肌細胞形態(tài)，提高細胞存活率，下調(diào)細胞凋亡介導(dǎo)蛋白caspase-3表達，降低細胞凋亡率；改善細胞中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性，降低培養(yǎng)液中MDA和心肌酶(AST、CPK、LDH)含量。提示山楂葉總黃酮對H2O2損傷乳鼠心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡具有抑制作用，作用機制可能與其能夠有效改善抗氧化酶活性、增強自由基清除能力、抑制氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)caspase-3、降低細胞凋亡率有關(guān)。

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Effects of hawthorn leaves favonoids on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2

YUAN Fang

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of hawthorn leaves favonoids(HLF) on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2. Methods Cadiocytes of neonate rat was separated and cultivated for 72 hours and divided into six groups: normal control group, H2O2 group, HLF(50, 100 and 200 μg/mL)+H2O2 groups and Shuxuening injection (100 μg/mL)+H2O2 group (n=10). 6 hours later, the morphology changes was observed under microscope and the survival rate was detected by MTT method; the content of AST, CPK, LDH in culture medium were detected by biochemistry analyzer; the activity of SOD, CAT, GSH-Px and the content of MDA in cardiomyocytes were also determinted by ultraviolet-visible spectrophotometer; the apoptosis rate were detected by flow cytometry, and the expression of caspase-3 in cardiomyocytes was detected by Western Blot and Semi-quantitative analyzed. Results Compared with the H2O2 group, the morphology of cardiomyocytes in HLF(100, 200 μg/mL)+H2O2 groups were improved and the survival rate was significantly increased, the activity of AST, CPK, LDH in culture medium were significantly decreased, the activity of SOD, CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased, the expression of caspase-3 and the apoptosis rate were significantly decreased; the activity of GSH-Px in cardiomyocytes of HLF 200 μg/mL treatment group was increased, the differences were all significant(P all<0.05). Conclusion HLF had protective effects on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2.

Key words:HLF; H2O2; cardiomyocytes; oxidative stress; apoptosis

[收稿日期]2015-09-27

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)04-0368-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.008

[作者簡介]袁芳，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心內(nèi)科臨床診治工作。