阮莎莎，劉桂華，劉素純*，朱　舟，劉建軍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)　食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南　長沙　410128；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東　深圳　518055)

同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定面粉及面制品中的聯(lián)二脲

阮莎莎1，劉桂華2*，劉素純1*，朱舟2，劉建軍2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳518055)

摘要：建立了面粉及其制品中聯(lián)二脲的同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。采用純水超聲提取，含油脂的樣品加正己烷脫脂，所得樣液進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以乙腈與純水為流動相，梯度洗脫，經(jīng)Waters XBridge BEH Amide(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱分離，MS/MS采用電噴霧電離正離子(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。方法的線性范圍為0.2～100 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；在面粉、饅頭、面包、油條和面條5種基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率為82.0%～113.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～9.3%；方法定量下限(LOQ)為20 μg/kg。應(yīng)用該方法對136份市售的面粉及面制品進(jìn)行檢測，在42份樣品中檢出聯(lián)二脲，檢出率為30.88%。其中面粉檢出4份，含量為43.7～564 μg/kg；饅頭未檢出；面條檢出2份，分別為70.8 μg/kg與9 840 μg/kg；油條檢出1份，含量為2 480 μg/kg；面包表層檢出15份，含量為27.4～8 730 μg/kg；面包內(nèi)芯檢出20份，含量為64.3～18 100 μg/kg。該方法操作簡單、靈敏快速、準(zhǔn)確可靠，適用于面粉及其制品中聯(lián)二脲的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素內(nèi)標(biāo)；面粉；面制品；聯(lián)二脲

偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide，ADC)具有氧化與漂白的雙重功能[1-2]，添加到面制品中能增強(qiáng)筋度，改善彈性、韌性及均勻性[3-4]。在面制品禁止使用溴酸鉀[5]后，ADC成為最廣泛使用的面粉改良劑之一。近年來研究表明，在面制品加工過程中，ADC可經(jīng)小麥蛋白還原成聯(lián)二脲(Biurea，HDC)，HDC經(jīng)高溫作用進(jìn)一步降解為氨基脲(Semicarbazide,SEM)[6-7]。SEM已被證明具有致癌性與致突變作用[8-10]。在高溫特別是濕度較大的情況下，ADC也可直接轉(zhuǎn)化為HDC[11]。歐盟已禁止使用ADC作為面粉添加劑[12]，我國GB2760-2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥粉中ADC的最大使用量為0.045 g/kg[13]?？紤]到其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物SEM的毒性效應(yīng)，有必要監(jiān)測食品中HDC的存在水平，這對使用ADC的食品的安全性評價有著重要意義。

目前，食品中HDC的定量分析方法主要為高效液相色譜法(HPLC)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。Bechtold等[14]最早利用HPLC檢測HDC。HDC的HPLC-MS/MS定量分析可直接測定或衍生后測定。如Mulder等[15]直接測定了含有面制品涂層的禽肉與海產(chǎn)品中HDC的含量；袁紅麗等[16]采用純水提取后固相萃取凈化測定了饅頭中的HDC含量，但該方法只針對饅頭中的HDC進(jìn)行研究，并未涉及其他面制品；王雅等[17]使用高錳酸鉀將HDC氧化成ADC，利用對苯亞磺酸鈉將ADC衍生為對苯磺酰氨基脲，再進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測，該方法的定量下限可達(dá)5 μg/kg，此方法雖然靈敏度較高，但需要衍生化，操作較為繁瑣。

本研究對面粉及面制品中的HDC進(jìn)行直接測定，采取純水直接提取，離心后取上清液，含油脂樣品加入正己烷脫脂，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，以期得到簡單高效、靈敏度高的HDC檢測方法，為檢測面粉及面制品中的HDC提供技術(shù)支持。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AB SCIEX 4500 QTRAP三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，配有Turbo-V離子源、蠕動泵以及Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，氣源為純度大于99.999%的高純氮?dú)猓籗himadzu LC-20A 超快速液相色譜儀(日本島津公司)；Waters XBridge BEH Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm×3.5 μm，美國Waters公司)；分析天平(XS205，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q plus超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Beckman Coulter AllegraTMX-22R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；KQ-250DV 超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA A-11 basic研磨機(jī)、IKA-MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜。

HDC標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%，美國Sigma-Aldrich公司)，13C2,15N2-HDC標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.8%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。實驗所用甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純，購自德國Merck公司。實驗用水(電阻率>18 MΩ·cm)均由Milli-Q plus超純水制備系統(tǒng)臨用現(xiàn)制。實驗用面粉及面制品購自深圳市各大超市。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取HDC標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)，加水超聲輔助溶解，配成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,4 ℃避光保存，有效期180 d；根據(jù)實際需要用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，獲得相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取13C2,15N2-HDC標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)，用超純水配成200 mg/L的溶液，置于4 ℃冰箱避光保存，有效期180 d；根據(jù)需要用甲醇稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3色譜-質(zhì)譜分析條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters XBridge BEH Amide 色譜柱(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱溫35 ℃；流動相為超純水(A)和乙腈(B)，流速為0.6 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min,75% B，0.5～2 min,75%～55% B，2～5 min,55% B，5～8 min,75%B；進(jìn)樣量20 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子噴霧電壓(IS)為5 500 V；離子源溫度(TEM)為650 ℃；氣簾氣(CUR)壓力35 psi；霧化氣(GS1)壓力45 psi；輔助加熱氣(GS2)壓力65 psi；碰撞氣(CAD)中等；去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)等參數(shù)見表1。

表1　HDC與13C2,15N2-HDC的MRM參數(shù)

*quantitative ion

1.4樣品前處理

面粉樣品直接稱取，面制品粉碎均勻取樣。準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g(精確至0.01 g)，分別加入0.1 mL13C2,15N2-HDC同位素內(nèi)標(biāo)(10 mg/L)和10 mL超純水，超聲提取15 min，轉(zhuǎn)出上清液；殘渣再用10 mL超純水提取1次，合并上清液；于8 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，用初始流動相稀釋至1 mL，0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾后采用LC-MS/MS測定；對于油條等油脂含量較高的樣品，提取液用初始流動相稀釋后加入2 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻30 s，于8 000 r/min離心5 min，取下清液過膜后測定。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將10 mg/L的HDC與13C2,15N2-HDC標(biāo)準(zhǔn)溶液以針泵注射器恒流進(jìn)樣，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，選擇最佳的電離方式及監(jiān)測離子。結(jié)果表明，在正離子模式下,[M+H]+為響應(yīng)度最強(qiáng)的離子，[M+Na]+次之。確定母離子后進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選取豐度較強(qiáng)的碎片離子作為定量離子和輔助定性離子，并進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。掃描質(zhì)譜圖及碎片裂解途徑解析見圖1。

2.2流動相的優(yōu)化

本實驗選擇乙腈與純水為流動相。在HPLC-MS/MS中，適量添加易揮發(fā)性酸可調(diào)節(jié)流動相pH值，優(yōu)化峰形，并在質(zhì)譜檢測中提高待測物質(zhì)的電離效率，從而提高檢測靈敏度?？疾炝肆鲃酉嘀刑砑硬煌w積分?jǐn)?shù)的甲酸和乙酸(0.1%，0.2%，0.5%，1.0%)對HDC電離效果與檢測靈敏度的影響。實驗顯示未添加酸時靈敏度最高，該結(jié)果與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果一致。因此最終選用乙腈與純水為流動相。

圖2　不同洗脫方式對HDC色譜峰的影響Fig.2　Effect of different elution patterns on MRM chromatograms of biurea

對流動相的洗脫方式進(jìn)行了優(yōu)化。因氨基柱的鍵合官能團(tuán)易水解，其有機(jī)相含量常保持在50%～95%。在此范圍內(nèi)改變有機(jī)相的變化速率，以獲得最佳色譜峰形與檢測靈敏度。最終優(yōu)化的梯度程序如“1.3”所示。在其他分析條件相同的情況下，與袁麗紅等[16]選用乙腈-水(70∶30)的等度洗脫相比，該梯度洗脫程序下HDC的出峰時間更早，信噪比為等度洗脫的3倍。圖2為上述2種洗脫方式下100 μg/L HDC的色譜峰比較圖。

2.3樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取劑的優(yōu)化食品中親水性污染物的常用提取溶劑主要有甲醇、乙腈或水溶液[18-19]，HDC的提取劑有純水[16-17]與二甲基甲酰胺[15]?？疾炝思兯?0%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液、10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑的提取效率。分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、面條) 2.00 g，添加100 μg/kg的HDC標(biāo)準(zhǔn)品，比較不同提取劑的提取效率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，純水作為提取劑時，提取效率最高。

由于提取劑在溶解提取待測物的同時會引入樣品基體中的其他雜質(zhì)，這些雜質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)值的影響稱為基質(zhì)效應(yīng)。不同的提取劑引入的雜質(zhì)不同，產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)也不同。本實驗對空白基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，采用處理后的基質(zhì)液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)點(diǎn)絕對響應(yīng)值的比值來衡量基質(zhì)效應(yīng)。比值小于1，說明基質(zhì)對待測物的響應(yīng)值有抑制作用；比值大于1，則說明基質(zhì)對待測物的響應(yīng)值有增強(qiáng)作用；比值越接近1，基質(zhì)對待測物響應(yīng)值的影響越小。結(jié)果顯示，以純水作為提取劑時，基質(zhì)效應(yīng)在0.95～1.13，10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑時，基質(zhì)效應(yīng)在0.51～0.63，50%乙腈水溶液與50%甲醇水溶液的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.79～0.88與0.74～0.80。因此，10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑時，對HDC質(zhì)譜響應(yīng)值有較強(qiáng)的抑制作用。此結(jié)果可合理解釋HDC更易溶于二甲基甲酰胺,因此10%二甲基甲酰胺水溶液的提取效率更低。綜合考慮提取效率與基質(zhì)效應(yīng)，最終選用純水作為提取劑。

表2不同提取劑對HDC提取效率的比較

Table 2Comparison between extraction efficiencies of different solvents for biurea

(μg/kg)

ExtractionsolventFlourSteamedbunNoodleBreadDeep-frieddoughsticksWater74.579.278.281.773.710%Dimethylformamide55.743.254.149.347.350%Acetonitrile54.362.154.943.851.550%Methanol43.152.237.051.743.2

2.3.2提取方法的優(yōu)化利用加標(biāo)面粉分別研究了不同提取方式、提取時間和提取次數(shù)對提取效率的影響。在不同提取方式中，超聲提取的加標(biāo)回收率為76.5%，遠(yuǎn)大于旋渦振蕩提取的回收率(32.4%)，因此本實驗選擇超聲提取。比較了超聲時間分別為10，20，30 min時對提取效率的影響，獲得其加標(biāo)回收率分別為65.2%，76.5%和79.1%，因此，實驗選擇最佳超聲時間為30 min。在提取次數(shù)的基礎(chǔ)上，同體積的提取劑分2次提取的回收率為87.9%，單次提取的回收率為67.3%。對于其他基質(zhì)也獲得了一致的結(jié)果。綜合考慮提取時間與提取次數(shù)，最終選定的提取方式為超聲提取，提取2次，每次15 min。

2.4同位素內(nèi)標(biāo)的應(yīng)用

由于面制品種類繁多，性質(zhì)差異大，采取基質(zhì)匹配方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，工作復(fù)雜繁瑣。而檢測物的同位素內(nèi)標(biāo)與檢測物的色譜行為與質(zhì)譜行為均一致。在樣品進(jìn)行前處理時即將同位素內(nèi)標(biāo)加入，不僅可以消除基質(zhì)效應(yīng)，也可校正操作帶來的損失與誤差。本實驗選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物13C2,15N2-HDC，比較了加標(biāo)樣品分別采用內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法定量計算的回收率。結(jié)果顯示，內(nèi)標(biāo)法定量的回收率為82.0%～113.6%，外標(biāo)法定量的回收率為62.4%～74.3%。因此本實驗最終采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.5方法性能

2.5.1線性范圍與檢出限取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用初始流動相稀釋成質(zhì)量濃度為 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100 μg/L 的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以HDC與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，HDC與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，HDC在0.2～100 μg/L范圍具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。

分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、面條)，添加HDC標(biāo)準(zhǔn)品，按照優(yōu)化后的最終方法進(jìn)行檢測，以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，HDC的LOD為5 μg/kg，LOQ為20 μg/kg。

2.5.2回收率與精密度選取經(jīng)測定不含HDC的面粉、饅頭、面包、油條、方便面5種空白基質(zhì)，分別按照50，500，2 000 μg/kg 3個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每個加標(biāo)水平做6個平行樣品，計算平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。HDC的平均回收率為82.0%～113.6%，RSD為2.1%～9.3%。

表3　加標(biāo)面粉及面制品的回收率與精密度測定結(jié)果(n=6)

2.6實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對市售的面粉(31份)、饅頭(12份)、面條(19份)、油條(10份)、面包(32份)進(jìn)行檢測。其中面包取樣時分為表層與內(nèi)芯，共獲得實際檢測樣品136份。42份樣品中檢出HDC，檢出率為30.88%。其中部分面制品樣品的檢出水平超出線性范圍，據(jù)第一次檢測值提高稀釋倍數(shù)，再次進(jìn)行測定。4份面粉樣品中檢出HDC，含量水平為43.7～564 μg/kg；饅頭中未檢出HDC，2份面條檢出HDC，含量分別為70.8 μg/kg與9 840 μg/kg；1份油條檢出HDC，含量為2 480 μg/kg；15份面包表層檢出HDC，含量水平為27.4～8 730 μg/kg，20份面包內(nèi)芯檢出HDC，含量水平為64.3～18 100 μg/kg。不同基質(zhì)實際樣品的提取離子流色譜圖見圖3。面包樣品中，同一樣品內(nèi)芯的HDC水平均高于表層，部分樣品內(nèi)芯中檢出HDC，但表層中未檢出。推測其原因為面包焙烤時，表層溫度更高，部分HDC受熱降解所致。

3結(jié)論

本文建立了面粉及其制品中HDC的同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品基質(zhì)中的HDC采用純水超聲提取，提取液稀釋后測定。方法無需衍生化，操作簡便快速，靈敏度高，檢測范圍廣，能夠滿足日常分析的要求，為面粉及面制品監(jiān)控提供了有力的技術(shù)支持。

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Determination of Biurea in Flour and Flour Products by Isotope Dilution High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

RUAN Sha-sha1,LIU Gui-hua2*,LIU Su-chun1*,ZHU Zhou2,LIU Jian-jun2

(1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128,China；2.Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen518055,China)

Abstract：An isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the determination of biurea in flour and flour products.The biurea in certain matrices was extracted with ultrapure water,defatted with n-hexane when necessary,and then analyzed by HPLC-MS/MS.LC separation was performed on a Waters XBridge BEH Amide column(3.5 μm，4.6 mm×150 mm) using ultrapure water and acetonitrile as mobile phase by gradient elution.Identification was achieved by electrospray ionization(ESI+) in positive mode using multiple reaction monitoring.Quantification was performed by isotope labeled13C2,15N2-biurea internal standard calibration.The calibration curve of biurea showed a good linearity in the range of 0.2-100 μg/L with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recoveries of biurea in flour,steamed bun,bread,deep-fried dough stick and noodle matrices(six aliquots for each level) at three spiked levels ranged from 82.0% to 113.6%,with RSDs of 2.1%-9.3%.The LOQ of the methed was 20 μg/kg.The optimized method was successfully applied in the analysis of 136 real samples collected from local markets in Southern China，while biurea residues were found in 42(30.88%) samples,of which 43.7-564 μg/kg of biurea existed in 4 flours,70.8-9 840 μg/kg in 2 noodles,2 480 μg/kg in 1 deep-fried dough stick,27.4-8 730 μg/kg in 15 breads-crust and 64.3-18 100 μg/kg in 20 breads-interior.This method is applicable for the determination of biurea in flour and different flour products due to its operation convenience,high sensitivity and good accuracy.

Key words：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);isotope labeled internal standard;flour;flour products;biurea

收稿日期：2015-09-23；修回日期：2015-10-15

基金項目：2014年深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20140410164217367)

*通訊作者：劉素純，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)，Tel:0731-84617007,E-mail:liusuchun@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.008

中圖分類號：O657.63;TQ225.261

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0420-06

劉桂華，碩士，主任技師，研究方向：食品安全與殘留物檢驗，Tel:0755-25601549,E-mail:gliu_686@hotmail.com