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(北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京100048)

酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶及其酶學(xué)特性研究

趙愛梅，趙笑，段紫怡,楊亞威，滕軍偉，楊貞耐

(北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京100048)

通過研究不同因素對酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響，確定適宜的產(chǎn)酶條件：酒曲添加量3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），發(fā)酵時(shí)間4 d，培養(yǎng)基初始pH值為6.0，搖床轉(zhuǎn)速120 r/m in。利用乙醇分級沉淀對酒曲發(fā)酵液中的凝乳酶進(jìn)行提取，得到體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇沉淀蛋白具有凝乳活力；進(jìn)一步進(jìn)行Sephadex G-75凝膠過濾得到純化凝乳酶，并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，確定酶的分子量為35.6 ku。對此純化酶的酶學(xué)特性的研究表明，該酶的最適溫度為40℃，pH值為5.4時(shí)酶活性最高，Ca2+，Zn2+，M g2+和K+對酶活性具有促進(jìn)作用，其中以Ca2+和Zn2+促進(jìn)作用較強(qiáng)；Cu2+，Na+和Fe2+對酶活性有抑制作用，其中Cu2+的作用較為顯著。該凝乳酶在干酪加工中具有潛在的應(yīng)用前景。

酒曲發(fā)酵；凝乳酶；提純；酶學(xué)特性

0 引 言

江米酒是利用酒曲發(fā)酵江米而形成的產(chǎn)物，其具有的凝乳作用是由酒曲微生物產(chǎn)生的蛋白酶引起的[1]。目前商業(yè)化凝乳酶的來源主要包括動(dòng)物、植物、微生物和基因工程凝乳酶。隨著近年來世界干酪產(chǎn)量的逐步提高，凝乳酶需求量也將不斷增加。由于微生物生長速度較快，發(fā)酵產(chǎn)量大，酶的提取方便有效，且生產(chǎn)成本較低[2]，利用微生物凝乳酶來進(jìn)行干酪生產(chǎn)是今后凝乳酶研究開發(fā)的趨勢[3]。

凝乳酶的凝乳活性受到酶濃度、體系溫度、pH值和離子濃度等反應(yīng)條件的影響[4,5]。在干酪生產(chǎn)過程中，在適宜條件下若凝乳酶的蛋白水解活性過高，則導(dǎo)致成熟干酪出現(xiàn)苦味[6]；若凝乳酶的耐熱性強(qiáng)，在干酪加工過程中殘留較高的酶活性，也會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)[7]。因此，獲得具有優(yōu)良酶學(xué)特性的凝乳酶對于確保干酪質(zhì)量至關(guān)重要[8]。

本研究對酒曲發(fā)酵江米產(chǎn)生的凝乳酶進(jìn)行分離提取純化，對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)適于干酪加工的凝乳酶制劑提供技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和設(shè)備

酒曲，糯米，脫脂乳粉，其他化學(xué)試劑均為分析純。

數(shù)顯恒溫水浴鍋HWS-12，電子天平PL-203，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272，低溫高速離心機(jī)CR 21G III，超純水制備系統(tǒng)Molgene1810a，博樂純化系統(tǒng)Bio-rad，博樂蛋白電泳系統(tǒng)Bio-rad Mini-Protein，全自動(dòng)凝膠成像儀Bio-rad。

1.2 不同因素對酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響

利用酒曲發(fā)酵糯米采用Zhao等[9]方法。將新鮮糯米洗凈后浸泡4 h，常壓下蒸煮30 m in，冷卻后，按如下對不同因素設(shè)定的參數(shù)，加入酒曲攪拌均勻，加入經(jīng)滅菌冷卻后的去離子水，于搖床中恒溫發(fā)酵。發(fā)酵完成后用中速定性濾紙對發(fā)酵液進(jìn)行過濾，取濾液按1.5方法測定凝乳活力。

1.2.1 酒曲接種量的影響

酒曲的添加量按1%，2%，3%，4%，5%和6%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）添加，水分添加量為0.5毫升每克熟化的糯米基質(zhì)；混勻后在30℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/m in，發(fā)酵3 d，發(fā)酵的初始pH值6.0。

1.2.2 發(fā)酵時(shí)間的影響

酒曲添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，水分添加量為0.5毫升每克熟化的糯米基質(zhì)；混勻后在30℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/m in；發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為2，3，4，5和6 d；發(fā)酵的初始pH值為6.0。

1.2.3 培養(yǎng)基初始pH值的影響

酒曲添加量為3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），水分添加量為0.5毫升每克熟化的糯米基質(zhì)；混勻后在30℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/m in發(fā)酵3 d；發(fā)酵的初始pH值設(shè)定為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0。

1.2.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響

按1.2.1所示方法進(jìn)行酒曲發(fā)酵，其中酒曲添加量為3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），水分添加量為0.5毫升每克熟化的糯米基質(zhì)；混勻后在30℃條件下進(jìn)行震蕩發(fā)酵3 d，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為80，100，120，140和160 r/m in，發(fā)酵的初始pH值為6.0。

1.3 凝乳酶的提取、純化和SDS-PAGE電泳分析

1.3.1 乙醇分級沉淀提取凝乳酶

取經(jīng)冷卻的酒曲發(fā)酵濾液采用乙醇分級沉淀法提取凝乳酶。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%和80%進(jìn)行分級沉淀；逐級添加所需乙醇，充分混勻后，靜置2 h；在4℃下，轉(zhuǎn)速為5 000 r/m in離心30 m in，收集上清進(jìn)行下一級沉淀，收集沉淀物作為分級蛋白，用去離子水溶解后，分別測定各級沉淀所得蛋白的凝乳活力，將具有酶活性的蛋白沉淀物進(jìn)一步冷凍干燥制成凝乳酶粗酶干粉待用。

1.3.2 凝膠過濾純化凝乳酶

將粗提凝乳酶干粉配置成質(zhì)量濃度為0.2 g/m L的溶液，溶劑為濃度0.05 mo l/L（pH值為5.8）的PBS溶液（配方：NaC l35 g，KC l1 g，KH2PO41.2 g，K2HPO49 g，添加蒸餾水定容至1 L，用乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.8）。采用Sephadex G-75柱子（2.6cm×60cm）進(jìn)行凝膠過濾，上樣量為4 m L，流速為1 m L/m in，洗脫液濃度為0.05 m ol/L（pH值為5.8）的PBS溶液，測定每個(gè)蛋白峰的凝乳活力，收集具有凝乳活力的洗脫峰即為純化酶。

1.3.3 SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE電泳參考汪家政等的方法[10-11]。純化凝乳酶樣品與樣品處理液以3:1的比例混勻，沸水浴煮5 m in后，轉(zhuǎn)速8 000 r/m in離心5 m in，上樣量為10 uL。電泳條件為分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%；電泳開始時(shí)電壓為60 V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至50 V。考馬斯亮藍(lán)R 250染色，然后脫色6 h，置凝膠成像儀觀察。

1.4 凝乳酶的酶學(xué)特性

1.4.1 凝乳酶的最適溫度

取5m L質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳，40℃保溫5 m in添加凝乳酶，添加量為10 SU/m L；分別在溫度20，25，30，35，40，45，50、55℃下測定純化凝乳酶的凝乳活力，以40℃時(shí)的凝乳活力為100%，計(jì)算相對凝乳活力。

1.4.2 pH值對凝乳酶活力的影響

取5 m L質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳，40℃保溫5 m in添加凝乳酶，添加量為10 SU/m L；以0.1 m ol/L的NaOH或HC l調(diào)整脫脂乳的pH值，分別在pH值為5.4，5.6，5.8，6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0時(shí)測定純化凝乳酶的凝乳活力；以pH值為5.8時(shí)的凝乳活力為100%，計(jì)算相對凝乳活力。

1.4.3 金屬離子對凝乳酶活力的影響

取5 m L質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳，分別添加N aC l，KC l，M gC l2，CaC l2，F(xiàn)eC l2，CuC l2，ZnC l2（濃度均為10 mm o l/L），40℃保溫5 m in添加凝乳酶，添加量為10 SU/m L；測定純化凝乳酶的凝乳活力，以空白對照的凝乳活力為100%，計(jì)算相對凝乳活力。

1.4.4 凝乳酶的最適鈣離子濃度

取一定量質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳，分別添加濃度10 mm ol/L的CaC l2將脫脂乳的鈣離子濃度調(diào)節(jié)為0.005，0.01，.0.015，0.02，0.025，0.03和0.035 m ol/L；取5m L不同鈣離子濃度的脫脂乳，40℃保溫5m in添加凝乳酶，添加量為10 SU/m L；測定純化凝乳酶的凝乳活力，以鈣離子濃度為0.02 m o l/L時(shí)的凝乳活力為100%，計(jì)算相對凝乳活力。

1.4.5 凝乳酶的最適鋅離子濃度

分別將脫脂乳內(nèi)的鋅離子濃度調(diào)節(jié)為0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03和0.035 m o l/L，取5 m L不同鋅離子質(zhì)量濃度的100 g/L脫脂乳，40℃保溫5 m in添加凝乳酶，添加量為10 SU/m L；測定純化后目的凝乳酶的凝乳活力時(shí)間，以鋅離子濃度為0.02 m ol/L時(shí)的凝乳活力為100%，計(jì)算相對凝乳活力。

1.5 凝乳酶活力測定

凝乳酶活力的測定采用A rim a[12]的方法。取5 m L質(zhì)量濃度100 g/L的脫脂乳，在35℃保溫5m in，加入0.5m L適當(dāng)稀釋的酶液或江米酒發(fā)酵液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入待測液到乳凝固的時(shí)間。以40 m in凝固用質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳1 m L所需的酶量定義為一個(gè)索氏單位(Soxhelt Unit，SU)，即

式中：T為凝乳時(shí)間(s)；D為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對酒曲微生物產(chǎn)凝乳酶的影響

2.1.1 酒曲添加量的影響

由圖1（a）可以看出，酒曲的接種量由1%增加至3%時(shí)，發(fā)酵液的凝乳活力迅速上升，且達(dá)到最大值，接種量大于3%后，凝乳活力有所下降。Shahta&Foda[13]所研究的產(chǎn)凝乳酶米曲霉LS1其最佳接種量為7.4× 106g-1,接種量過高會(huì)引起酶產(chǎn)量的下降，從而使酶活性相對降低。這可能是當(dāng)接種量增加時(shí)，發(fā)酵液的微生物數(shù)量隨之增加，當(dāng)微生物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，由于培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)有限，使產(chǎn)酶微生物的生長受到限制，從而影響了凝乳酶的生產(chǎn)，酶活力也相應(yīng)降低[14]。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的影響

由圖1（b）可知，在發(fā)酵初期發(fā)酵液的凝乳活力逐漸增加，第4天時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長凝乳活力逐漸降低。這與發(fā)酵液中產(chǎn)酶微生物的生長密切相關(guān)。發(fā)酵初期培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)充足，產(chǎn)酶微生物迅速增加，成為優(yōu)勢菌群，當(dāng)?shù)竭_(dá)第4天時(shí)，微生物數(shù)量達(dá)到最高，凝乳酶的產(chǎn)量最大。隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長，可能是由于目標(biāo)產(chǎn)酶微生物數(shù)量的急速下降及衰亡而不能很好地抑制雜菌的生長，同時(shí)發(fā)酵液中某些營養(yǎng)成分或中間代謝產(chǎn)物可能對產(chǎn)酶有抑制作用，從而使發(fā)酵液中酶活力降低;Escobar &Barnett[15]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用不同水解程度的酪蛋白來代替發(fā)酵體系中的酪蛋白來生產(chǎn)凝乳酶，隨著酪蛋白水解程度的增加，酶的產(chǎn)量下降，因此發(fā)酵過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物游離氨基酸可能抑制微生物產(chǎn)酶。

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH的影響

由圖1（c）可知，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值從4.5升至5.5時(shí)，酒曲微生物所產(chǎn)凝乳酶的活力緩慢升高；pH值升至6.0時(shí)凝乳活力達(dá)到最大值。當(dāng)pH值超過6.0后，凝乳活力迅速下降。Higashio&Yoshioka[16]研究發(fā)現(xiàn)，利用總狀毛霉N o.50發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶時(shí)，在酶產(chǎn)量達(dá)到最大值后,酶活性急劇減少,而調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的初始pH值到5.0并維持在6.4以下能夠使這中酶活性下降的趨勢被抑制。這可能是由于酒曲微生物凝乳酶大多屬于酸性蛋白酶，其最適pH值為1.5～6.0[17]。

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響

由圖1（d）可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速由80 r/m in增至100 r/m in，發(fā)酵液凝乳活力稍微增加，繼續(xù)升高至120 r/m in時(shí)，凝乳活力迅速上升并達(dá)到最大值，之后逐漸下降。一般來說，改變搖床的轉(zhuǎn)速可以導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)溶氧量的變化，進(jìn)而影響產(chǎn)酶微生物的生命活動(dòng)。提高發(fā)酵體系的溶氧量，有利于需氧微生物的生長，但是溶氧量過高，也會(huì)使微生物生長受到影響，因此合適的溶氧量對產(chǎn)酶微生物的生長有重要的意義[18]。

2.2 酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的提取、純化和SDS-PAGE電泳分析

根據(jù)上述對酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶條件的研究，確定適宜的產(chǎn)酶條件：酒曲添加量3%，發(fā)酵時(shí)間4 d，培養(yǎng)基初始pH值為6.0及搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/m in。在此條件下利用酒曲發(fā)酵糯米（水分添加量為0.5毫升每克熟化的糯米基質(zhì)），發(fā)酵液經(jīng)過濾后用于凝乳酶的提純。

2.2.1 乙醇分級沉淀提取凝乳酶

圖1 發(fā)酵條件對酒曲微生物產(chǎn)凝乳酶的影響

對酒曲發(fā)酵濾液的乙醇分級沉淀物測定其凝乳活力，結(jié)果表明，只有乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)其沉淀得到的蛋白質(zhì)具有很好的凝乳效果，表明此蛋白沉淀物具有凝乳酶活力，進(jìn)一步冷凍干燥即得凝乳酶粗酶品。本研究結(jié)果與前人有關(guān)霉菌凝乳酶提取的結(jié)果類似。潘道東等[19]通過乙醇分級沉淀提取根霉凝乳酶，當(dāng)添加的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，凝乳酶的得率最大；Hashem[20]對青霉凝乳酶進(jìn)行提純，當(dāng)添加的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～70%時(shí)沉淀得到的蛋白質(zhì)其凝乳活力最高。

圖2 酒曲發(fā)酵液乙醇分級沉淀蛋白的SDS-PAGE電泳

圖2為酒曲發(fā)酵濾液的乙醇分級沉淀物的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。由圖2可以看出，乙醇分級沉淀物的蛋白條帶分布在分子量10～100 ku之間，其中體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇沉淀物的蛋白條帶在34～43 ku之間，與50%，60%和80%乙醇沉淀物的蛋白條帶分布位置不同。根據(jù)上述凝乳活力的測定結(jié)果，確定體積分?jǐn)?shù)70%乙醇沉淀物的蛋白條帶即為凝乳酶組分（M CE）。

2.2.2 凝膠過濾純化凝乳酶及其SDS-PAGE電泳分析

乙醇分級沉淀所得的凝乳酶粗酶經(jīng)Sephadex G-75分子篩層析柱進(jìn)一步分離純化，得到兩個(gè)明顯的洗脫峰（圖3）。經(jīng)過測定凝乳活力，第一個(gè)洗脫峰具有凝乳活力，而第二個(gè)洗脫峰無凝乳活力。收集洗脫峰1的洗脫液，使用分子量為10 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液進(jìn)一步冷凍干燥得到純化凝乳酶。

圖3 Sephadex G-75對酒曲微生物凝乳酶的純化

對純化凝乳酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在約35 ku處可見酶蛋白條帶（圖4A）。以蛋白質(zhì)的遷移距離與示蹤染料的遷移距離的比值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4B），經(jīng)計(jì)算得到本研究的酒曲微生物凝乳酶（M CE）的分子量為35.6 ku。據(jù)報(bào)道，小牛皺胃酶分子量為35.65 ku，米黑毛霉所產(chǎn)凝乳酶的分子量為34.0～39.0 ku之間，根霉所產(chǎn)凝乳酶分子量約為35 ku[9]。滕國新[21]等報(bào)道，酒曲中根霉凝乳酶的分子量為36.6 ku。本研究所得凝乳酶分子量與上述結(jié)果接近。程巧玲[22]等認(rèn)為，酒曲中的霉菌是產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)勢菌群，因?yàn)樵诰魄l(fā)酵過程中，霉菌數(shù)量與發(fā)酵液凝乳活力的變化趨勢一致。因此，初步推測本研究所得凝乳酶很有可能是酒曲中霉菌產(chǎn)生的。

圖4 酒曲微生物凝乳酶的SDS-PAGE電泳分析

2.3 凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 凝乳酶的最適溫度

圖5為溫度對酒曲微生物凝乳酶活力的影響。由圖5可以看出，溫度在20～40℃之間時(shí)，凝乳酶的凝乳活力隨溫度的升高而增加，40℃時(shí)酶活達(dá)到最大值。溫度在40～55℃之間時(shí)，凝乳酶的凝乳活力隨溫度的升高顯著下降，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)凝乳活力幾乎完全消失。

據(jù)報(bào)道，小牛皺胃酶的最適溫度為50℃[23]；微小毛霉、米黑毛霉和草酸青霉所產(chǎn)凝乳酶的最適溫度分別為55，60和65℃[24-25]；蔣曉雪等[26]對酒曲凝乳酶的酶學(xué)特性研究表明其最適溫度為35℃。本研究的酒曲微生物凝乳酶的最適溫度為40℃。通常干酪制作時(shí)需經(jīng)過熱燙（約為50℃）處理，在此溫度條件下，本研究的酒曲微生物凝乳酶將受熱失活，從而減少凝乳塊中凝乳酶殘留活性，有利于避免干酪成熟期間因蛋白過度降解導(dǎo)致苦味肽的產(chǎn)生。

2.3.2 pH值對凝乳酶活力的影響

由圖6可以看出，隨著pH值的逐漸升高，凝乳酶活力不斷降低，pH值為5.4時(shí)凝乳活力最高；pH值趨于中性時(shí)，凝乳活力顯著降低；pH值為7.0時(shí)凝乳活力幾乎消失。有研究表明，毛霉所產(chǎn)凝乳酶在pH值為5.5時(shí)表現(xiàn)出最高的凝乳活力，青霉所產(chǎn)凝乳酶在pH值為4.0時(shí)凝乳活力最高；薛璐等[27]研究酒曲凝乳酶在pH值為6.5時(shí)表現(xiàn)出最大活力。當(dāng)pH值從7.0下降到4.0～5.0時(shí),大部分商用凝乳酶的凝乳活力呈線性增加[28]。多數(shù)凝乳酶在中性或弱堿性條件下凝乳酶活力的顯著損失可能與其在此條件下酶空間構(gòu)象發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化有關(guān)[29]。

圖5 溫度的影響

圖6 pH值的影響

2.3.3 金屬離子對凝乳酶活力影響

不同金屬離子對酒曲微生物凝乳酶活力的影響如圖7所示。由圖7可能看出，Ca2+，Zn2+，M g2+和K+對凝乳酶活力有促進(jìn)作用，其中Ca2+的促進(jìn)作用最強(qiáng)，依次為Zn2+、M g2+和K+。與對照組相比，添加10 mm o l/L CaC l2可以使凝乳酶的活力提高約1倍左右。有研究表明，Ca2+能夠和酪蛋白膠束中的膠體磷酸鈣進(jìn)行離子交換，從而使膠束表面的電荷減少，膠束彼此間的空間斥力減小而易于靠近并大量聚集促進(jìn)凝乳；同時(shí)，Ca2+與H+之間進(jìn)行交換可以降低凝乳體系的pH值，間接加快酶促反應(yīng)[30]。Cu2+，Na+和Fe2+對凝乳酶的活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最為顯著。薛璐等[27]對酒曲凝乳酶的研究表明，K+、Ca2+，M g2+，Zn2+均能促進(jìn)凝乳，而Na+對凝乳活力也具有一定的促進(jìn)作用，其中Ca2+的作用最為明顯；Cu2+對凝乳酶的活力有抑制作用。吳進(jìn)菊等[31]的研究表明，Ca2+，M g2+對酒曲凝乳酶的活力具有促進(jìn)作用，而Na+和Cu2+具有抑制作用，K+具有抑制作用。因此，金屬離子對于不同來源的酒曲凝乳酶的活性有不同的影響。在制作干酪的過程中要選擇合適種類和數(shù)量的鹽，以達(dá)到最佳的凝乳效果，確保干酪質(zhì)量。

圖7 金屬離子對酒曲微生物凝乳酶活力的影響

2.3.4 凝乳酶的最適鈣離子和鋅離子濃度

如上所述，Ca2+和Zn2+對酒曲微生物凝乳酶的活力影響顯著。進(jìn)一步研究表明（圖8），隨著脫脂乳中Ca2+或Zn2+濃度的增加，凝乳酶的活力也隨之升高，當(dāng)Ca2+或Zn2+濃度增加至0.02 m ol/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值；之后隨著Ca2+或Zn2+濃度增加，凝乳活力下降，但前者酶活力下降得更緩慢些。因此，酒曲微生物凝乳酶的最適鈣離子和鋅離子濃度均為0.02 m ol/L。當(dāng)Ca2+或Zn2+濃度為0.02 m o l/L時(shí)凝乳速率最快，凝固效果最好，對凝乳酶活力的促進(jìn)作用最為顯著。

圖8 鈣離子和鋅離子對酒曲微生物凝乳酶活力的影響

3 結(jié) 論

通過研究不同因素對酒曲發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響，確定適宜的產(chǎn)酶條件為：酒曲添加量3%，發(fā)酵時(shí)間4 d，培養(yǎng)基pH值為6.0，搖床轉(zhuǎn)速120 r/m in。在此條件下進(jìn)行酒曲發(fā)酵，對發(fā)酵液中的凝乳酶進(jìn)行乙醇分級沉淀提取和Sephadex G-75凝膠過濾，獲得純化凝乳酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，獲單一蛋白條帶，其分子量為35.6 ku。該凝乳酶最適溫度40℃，高于55℃時(shí)酶活性完全喪失。該酶在偏酸性條件下具有較高的凝乳活力。Ca2+，Zn2+，M g2+和K+對該酶活性具有不同程度的促進(jìn)作用，其中Ca2+和Zn2+的促進(jìn)作用強(qiáng)，酶的最適Ca2+和Zn2+濃度均為0.02 m o l/L；Cu2+，N a+和Fe2+對酶活性具有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用較顯著。本研究結(jié)果表明，酒曲微生物凝乳酶耐熱性相對較差，適于干酪加工；在干酪加工過程中使用不同鹽分時(shí)，應(yīng)注意金屬離子的種類及濃度對酶活性的影響。后續(xù)研究著力于該酶的凝乳機(jī)理及在干酪加工中的應(yīng)用。

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Production of a milk-clotting enzyme by Jiuqu starter fermentation and enzymatic properties of the enzyme

ZHAO Ai-mei,ZHAO Xiao,DUAN Zi-yi,YANG Ya-wei,TENG Jun-wei,YANG Zhen-nai
(Beijing Technology and Business University Beijing Laboratory O f Food Quality and Safety,Beijing 100048,China)

By studying different factors influencing production of am ilk-clotting enzyme by Jiuqu starter fermentation,the suitable conditions for producing the enzyme were determined:addition of Jiuqu starter 3%,fermentation time 4 days,initial medium pH6.0 and rotation speed 120rpm.The enzyme was extracted from the fermentation liquor by step-wise ethanol precipitation from 50%to 60%,70%and 80%, and the 70% ethanol precipitate was found with milk-clotting activity.This active fraction was further purified by Sephadex G-75 gel filtration and analyzed by SDS-PAGE electrophoresis,showing the molecular weight of the enzyme of 35.6 ku.The purified enzyme had an optimal reaction temperature of 40℃,and the optimal pH of 5.4.Ca2+,Zn2+,Mg2+and K+stimulated the enzyme activity,with Ca2+and Zn2+having stronger effect.Cu2+,Na+and Fe2+had inhibitory effect on the enzyme activity,with Cu2+having stronger effect.Them ilk-clotting enzyme could be potentially used in cheese processing.

Jiuqu starter fermentation;Milk-clotting enzyme;Extraction and purification;enzymatic properties

Q93-33

：A

：1001-2230（2016）02-0016-06

2015-07-27

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303085）;北京市百千萬人才工程資助項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371804)。

趙愛梅（1989-），女，研究生，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぁ?/p>