（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

腸膜明串珠菌及其近緣種dnaA和rpoB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

馮淑貞，徐海燕，宋宇琴，張和平，孫志宏

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

比較16S rRNA基因、dnaA、rpoB部分基因序列對(duì)Leuconostoc mesenteroides（Leu.mesenteroides）及其近緣種的分辨力，為腸膜明串珠菌提供快速準(zhǔn)確的鑒定方法。以分離自自然發(fā)酵乳制品中的8株Leu.mesenteroides為研究對(duì)象，以其看家基因dnaA、rpoB部分基因序列作為分子標(biāo)記，結(jié)合GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的近緣種及亞種的相應(yīng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并與16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)，基于Leu.mesenteroides及其近緣種的dnaA和rpoB部分基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與16S rRNA基因基本一致，但分辨率高于16S rRNA基因；種間的dnaA和rpoB部分基因序列相似性分別為81.7～84.8%和85.5、87.4%，而種間16S rRNA基因相似性為98.1%～99.5%。相較于16S rRNA基因，dnaA和rpoB基因更容易鑒定腸膜明串珠菌及其近緣種，其中rpoB可明晰區(qū)分試驗(yàn)菌株與腸膜明串珠菌亞種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因此rpoB基因可作為16S rRNA基因的輔助工具用于Leu.mesenteroides及其近緣種的快速鑒定。

腸膜明串珠菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；16S rRNA基因；dnaA；rpoB

0 引 言

腸膜明串珠菌為革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧且不產(chǎn)芽孢的球形細(xì)菌，常存在于植物體表[2]，目前包括腸膜明串珠菌葡聚糖亞種、乳脂亞種、腸膜亞種和最新分離得到的Leu.mesenteroides subsp.suionicum[6-7]，它們均在食品工業(yè)中扮演重要角色[3]，然而傳統(tǒng)的生理生化反應(yīng)以及16S rRNA基因序列因自身局限不足以對(duì)近緣種或亞種進(jìn)行分類(lèi)鑒定[2，9-10]，因此，有必要為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供快速準(zhǔn)確的分類(lèi)鑒定方法，看家基因作為重要蛋白的編碼基因，進(jìn)化速率快且分辨能力強(qiáng)，特別適用于近緣菌株的區(qū)別和鑒定[12]。

本研究利用16S rRNA基因序列結(jié)合dnaA和rpoB的部分看家基因序列分析了分離自發(fā)酵乳制品中的8株試驗(yàn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，充實(shí)多相分類(lèi)鑒定以便分類(lèi)學(xué)地位準(zhǔn)確無(wú)誤，為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供快速準(zhǔn)確的鑒定方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

（1）實(shí)驗(yàn)菌株。本文所用的8株腸膜明串珠菌均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)菌株的16S rRNA基因、dnaA和rpoB基因序列登錄號(hào)見(jiàn)對(duì)應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖括號(hào)內(nèi)所示。

（2）主要試劑和儀器。Applied biosystems PCR儀，ND-1000型微量紫外分光光計(jì)，CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，HZS-H水浴震蕩器，PL303/01電子天平，Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)，ML-30L型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，DYY-12電泳儀等。

（3）實(shí)驗(yàn)所用引物。通過(guò)比較基因組學(xué)分析，選擇dnaA和rpoB兩個(gè)單拷貝且含有多變區(qū)的基因?yàn)槟繕?biāo)序列，結(jié)合序列比對(duì)信息，采用Prim er 5.0設(shè)計(jì)通用引物并由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

菌體DNA提取采用CTAB-液氮凍融法[13]，在此基礎(chǔ)上針對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品改進(jìn)后具體步驟為：取適量菌體于1.5m L的EP管中，加入500μL TE緩沖液并用吸管反復(fù)吹打，使之重懸，置于液氮中反復(fù)凍融3-4次，然后加入80μL質(zhì)量濃度為100 g/L的SDS和10μL質(zhì)量濃度為20 g/L的蛋白酶K，混勻，于37℃搖床4 h。再加入80μL濃度為10 m o l/L的CTAB溶液及100μL濃度為5mo l/L的NaC l溶液，混勻，于65℃水浴30m in，得到粗提取液。在此粗提取液中，加入700μL酚/氯仿/異戊醇（V酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1），顛倒混勻，離心（12 000 g，10 m in）；取上清，并加入700μL氯仿/異戊醇（V氯仿∶V異戊醇=24∶1），顛倒混勻，離心（12 000 g，10 m in），取上清，加入500μL冷的異丙醇和50μL 3 m ol/L的N aAc，輕輕混合，直到DNA沉淀下來(lái)，離心（12 000 g，10 m in）后，棄去上清，得到DNA沉淀，用500μL 70%的乙醇洗滌DNA兩次。最后用50μL TE溶解DNA，并加入適量R NaseA，4℃放置過(guò)夜后，將提取的基因組DNA稀釋到100μg/L作為PCR擴(kuò)增模板，反應(yīng)體系50μL。其中dnaA基因的擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 m in；95℃變性1 m in，52℃退火45 s，72℃延伸1 m in，30個(gè)循環(huán)；72℃末端延伸10 m in。rpoB基因擴(kuò)增條件的除了退火溫度為56℃，其余反應(yīng)條件均與dnaA一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

8株試驗(yàn)菌株的dnaA和rpoB基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序獲得相應(yīng)的核苷酸序列。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載試驗(yàn)菌株、參考菌株的16S rRNA基因序列，以及參考菌株的dnaA和rpoB基因序列（序列登錄號(hào)見(jiàn)對(duì)應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖括號(hào)內(nèi)所示），采用M ega6.0軟件進(jìn)行C lustalW比對(duì)，運(yùn)用鄰接法（Neighour-joining，N-J）分別構(gòu)建試驗(yàn)菌株、參考菌株的16S rRNA基因和dnaA、rpoB部分基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1 000次。

2 結(jié)果和分析

2.1 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

8株試驗(yàn)菌株和6株參考菌株的16S rRNA基因序列下載自GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)多重序列比對(duì)，獲得比對(duì)整齊的序列文件并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，共劃分出A、B、C 3個(gè)較為穩(wěn)定的大類(lèi)群。其中，8株試驗(yàn)菌株和Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T、Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T聚為A類(lèi)群，它們兩兩之間的16S rRNA基因序列的平均相似性等于或大于99%；A類(lèi)群與B類(lèi)群Leu.pseudomesenteroides分支的平均相似性為99.5%，與C類(lèi)群leu.citreum的平均相似性為98.1%，這與Saw a[14]、Elizaqunvel[15]、Laguerre[16]等人的研究結(jié)論一樣，即腸膜明串珠菌與其近緣種的16S rRNA基因序列相似性高且進(jìn)化速率較低，因此當(dāng)對(duì)腸膜明串珠菌亞種及其近緣種之間進(jìn)行區(qū)別時(shí)，需要選用一種較16S rRNA基因分辨率高的方法及工具。

圖1 8株試驗(yàn)菌株與參考菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 dnaA和rpoB部分基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 8株試驗(yàn)菌株與參考菌株的dnaA、rpoB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

基于dnaA部分基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中（圖2），8株試驗(yàn)菌株與6株參考菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與16S rRNA基因的基本相同，仍形成A、B、C 3大類(lèi)群，區(qū)別在于相似性不同，其中A類(lèi)群與B類(lèi)群兩兩菌株之間的基因平均相似性為84.8%，與C類(lèi)群之間基因平均相似性為81.7%，這表明相較于16S rRNA基因序列，dnaA基因序列在鑒定明串珠菌屬內(nèi)各近緣種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)分辨率更高。但遺憾的是，dnaA基因同源性不足以區(qū)分腸膜明串珠菌的亞種，模式菌株Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T和Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T的基因相似性為100%，可能的原因是由于用于本文構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的dnaA基因片段長(zhǎng)度僅312 bp，未能提供足夠的序列信息造成。

基于rpoB部分基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中（圖2），8株試驗(yàn)菌株與6株參考菌株仍形成較為穩(wěn)定的A、B、C 3大類(lèi)群，其中A類(lèi)群與B類(lèi)群菌株兩兩之間基因的平均相似性為87.4%，與C類(lèi)群之間基因平均相似性為85.5%，分辨率高于16S rRNA基因，類(lèi)似地，Shevtsov等人也表明rpoB基因在分析乳桿菌屬內(nèi)近緣種的親緣關(guān)系時(shí)較16S rRNA分辨率高[17]。另外在亞種水平上，試驗(yàn)菌株（A類(lèi)群）可明顯分為3個(gè)分支，其中IM AU 80244、IM AU 80358、IM AU 20659、IM AU 10406與模式菌株Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293T聚為Ⅰ亞群，IM AU 20671、IM AU 80420與模式菌株Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T聚為II亞群。IM AU 80347與IM AU 80748未與參考菌株劃分為一類(lèi)，它們與模式菌株Leu.mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293T的相似性為99.5%，與模式菌株Leu.mesenteroides subsp.cremoris ATCC 19254T的相似性為99.1%。

另對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的8株試驗(yàn)菌株以及參考菌株的dnaA、rpoB及16S rRNA的基因序列進(jìn)行了多態(tài)性分析（表2），結(jié)果表明，2個(gè)看家基因的多態(tài)性位點(diǎn)比率均比16S rRNA基因高，dnaA基因的多態(tài)性位點(diǎn)比率最高，為27.1%，rpoB基因多態(tài)性位點(diǎn)比率為21.24%，遠(yuǎn)高于16S rRNA基因的2.52%。遺傳距離可以反映同屬不同種之間基因差別的程度，結(jié)果顯示各看家基因的遺傳距離也均大于16SRNA。綜上所述看家基因相較于16S rRNA基因在區(qū)分腸膜明串珠菌近緣種及亞種時(shí)有著更高的分辨率，其中rpoB可明晰區(qū)分試驗(yàn)菌株與腸膜明串珠菌亞種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因此rpoB基因可作為16S rRNA基因的輔助工具用于Leu.mesenteroides及其近緣種的快速分離鑒定。

表2 腸膜明串珠菌16S rRNA基因及看家基因多態(tài)性分析

表2中，保守性位點(diǎn)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比率為多態(tài)性位點(diǎn)與所有位點(diǎn)的比值由DNAsp5得出，各基因比對(duì)后片段長(zhǎng)度、基因距離與基因距離平均值則由MEGA6.0計(jì)算得出。

3 討 論

細(xì)菌16S rRNA基因兼有保守區(qū)與可變區(qū)，使得它成為研究細(xì)菌分類(lèi)進(jìn)化的重要工具[18-19]，然而隨著生物信息學(xué)的日益發(fā)展科研人員發(fā)現(xiàn)，16S rRNA基因在區(qū)分近緣種時(shí)往往顯示出較低的分辨率[9-10]。張文羿[9]等人利用看家基因clpx、recA將經(jīng)傳統(tǒng)生理生化和16S rRNA基因序列鑒定的9株Enterococcus faecium和1株Enterococcus durans重新劃分為Enterococcus faecalis，成功將16S rRNA基因無(wú)法區(qū)分的菌株準(zhǔn)確鑒定到種水平。2007年，Bruyne[20]等人對(duì)分離自埃塞俄比亞咖啡中的乳酸菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果表明這株菌與Leuconostoc cireum（Leu.cireum）以及Leuconostoc lactis(Leu.lactis)的16S rRNA基因序列相似性分別是99.6%和99.0%，故未能將其準(zhǔn)確劃分到種水平，但通過(guò)聯(lián)合看家基因、DNA雜交等技術(shù)將分離得到的菌株劃分為新種Leuconostoc holzapfeliisp. nov.。類(lèi)似地，呂嬙[10]等人對(duì)比研究了16S rRNA基因以及dnaA、murC和pyrG看家基因序列對(duì)Leu.cireum、Leu.lactis的區(qū)分能力，結(jié)果表明：看家基因相較于16S rRNA基因具有更高的分辨率，在研究近緣種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)。早前有研究指出腸膜明串珠菌與檸檬明串珠菌、假腸膜明串珠菌等近緣種的16S rRNA基因序列相似性大于97%[14-16]，因此僅利用16S rRNA基因序列無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，本文構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也證明了這一結(jié)論，因此本文研究腸膜明串珠菌及其近緣種的親緣關(guān)系選用了分辨率更高的看家基因序列作為輔助工具，這樣一來(lái)，克服了16S rRNA基因的局限性。

本研究通過(guò)比較16S rRNA基因，dnaA和rpoB基因的構(gòu)建的N-J樹(shù)發(fā)現(xiàn)，看家基因與16S rRNA基因表現(xiàn)出了較高的一致性，表明本文所選的看家基因可以作為16S rRNA基因的輔助工具用于今后明串珠菌屬內(nèi)近緣種的快速準(zhǔn)確鑒定，另外利用rpoB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)在亞種水平的區(qū)分能力高于dnaA，但遺憾的是，亞種之間的差異性小于1%，因此需要進(jìn)一步聯(lián)合分辨率高的看家基因或通過(guò)傳統(tǒng)生理生化鑒定與分辨率高的看家基因相結(jié)合來(lái)區(qū)分腸膜明串珠菌亞種的系統(tǒng)進(jìn)化地位。

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Phylogenetic analysis of closely related Leuconostoc mesenteroides species based on dnaA and rpoB gene homologues

FENG Shu-zhen，XU Hai-yan，SONG Yu-qing，ZHANG He-ping，SUN Zhi-hong
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)

The study aimed to compare the efficiency of 16S rRNA，dnaA，rpoB gene on the phylogenetic relationship of Leu.mesenteroides and its related species，to provide a rapid identification method of the Leu.mesenteroides strains.Two housekeeping genes，dnaA and rpoB gene，of eight Leu.mesenteroides strains originally isolated from traditional dairy products were used as phylogenetic markers to construct the phylogenetic trees with the published corresponding gene sequences of reference strains in Genbank.The phylogenetic trees of 16S rRNA gene of tested strains and reference strains were also constructed.The topologies of the two housekeeping genes trees were consistent with that of 16S rRNA gene.How ever，homology of the close related Leu.mesenteroides species based on dnaA，rpoB and 16S rRNA gene sequences was different，ranging from 81.7%to 84.8%，85.5%to 87.4%，and 98.1%to 99.5%，respectively.Com pared with 16S rRNA gene，the dnaA and rpoB gene，were more appropriate for phylogenetic identification of Leu.mesenteroides and its related species.Meanwhile，considering the rpoB gene is competent to distinguish the test strains at the subspecies level，it can be used as an auxiliary tool for rapid classification and identification of Leu.mesenteroides and its related species.

Leu.mesenteroides；phylogenetic analysis；16SrRNA gene；dnaA；rpoB

Q93-33

：A

：1001-2230（2016）02-0008-04

2015-09-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31430066）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2011AA100901）。

馮淑貞（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。

孫志宏