萬紅才　段　萍　徐作剛　曾　琦

貴州省黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州　都勻　558000

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金烏骨通膠囊中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定

萬紅才段萍徐作剛曾琦

貴州省黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州都勻558000

【摘要】目的：建立測定金烏骨通膠囊中原兒茶酸和原兒茶醛含量的方法。方法：采用高效液相色譜法；色譜條件：安捷倫 C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)，甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相(梯度洗脫)，流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：256nm。結(jié)果：原兒茶酸在0.0793～0.4758μg范圍內(nèi)、原兒茶醛在0.00526～0.3153μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；原兒茶酸平均回收率為97.01%，RSD 為1.41%(n=6)；原兒茶醛平均回收率為98.19%，RSD為1.82%(n=6)。結(jié)論：原兒茶酸峰與原兒茶醛峰及其他雜質(zhì)峰能夠有效分離，其方法簡便，準(zhǔn)確度、靈敏度高，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，能夠滿足本品有效成分質(zhì)量控制的要求。

【關(guān)鍵詞】金烏骨通膠囊；高效液相色譜法；原兒茶酸，原兒茶醛；含量測定

金烏骨通膠囊由金毛狗脊、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、姜黃、補(bǔ)骨脂、木瓜、土牛膝、土黨參、威靈仙等十味藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，臨床用于肝腎不足、風(fēng)寒濕痹、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生引起的腰腿酸痛、肢體麻木等癥狀[1]。其中，金毛狗脊、木瓜的活性成分主要是原兒茶酸和原兒茶醛[2-3]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，原兒茶酸和原兒茶醛具有增加冠脈流量、抗炎等活性，體外具有抑血小板聚集、抗菌等生理活性[4-5]。有文獻(xiàn)采用薄層色譜法鑒別金烏骨通膠囊中的原兒茶酸和原兒茶醛[6]；研究采取高效液相色譜法測定其原兒茶酸和原兒茶醛含量，有助于更好的控制該藥品質(zhì)量。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1260 高效液相色譜儀；梅特勒AG135電子天平；島津UV-2401紫外分光光度計(jì)。

1 .2材料原兒茶酸(批號(hào)：810-200205)、原兒茶醛(批號(hào)：110810-200205)對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所；金烏骨通膠囊由貴州盛世龍方制藥有限公司提供；甲醇、乙腈均為色譜純；水為娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(250mm×4. 6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液，按表1梯度洗脫；流速：1.0ml/min，柱溫：35℃；檢測波長：256nm。

表1　甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液梯度洗脫表

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一容量瓶中，加甲醇制成分別含原兒茶酸15.86μg/ml和原兒茶醛 10.51μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取樣品5g，精密稱定，精密加50ml乙酸乙酯，稱重，水浴回流30min，放冷，用乙酸乙酯補(bǔ)足重量，濾過，取續(xù)濾液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并轉(zhuǎn)移置5ml量瓶中，加1%的冰醋酸至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中分別呈現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜圖中保留時(shí)間相一致的兩色譜峰，原兒茶酸與原兒茶醛兩成分峰的分離度較好，與相鄰雜質(zhì)峰完全分離,陰性無干擾。見圖1。

2.4線性關(guān)系試驗(yàn)取“2.2.1”的對(duì)照品溶液，分別精密吸取5、10、15、20、25、30μl注入色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣質(zhì)量數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得原兒茶酸的回歸方程Y=4748.43767X-8.12860，r= 0.99999；原兒茶醛的回歸方程Y= 2003.05491X-4.81000，r= 0.99995。結(jié)果表明，原兒茶酸在0.0793～0.4758μg、原兒茶醛在0.00526～0.3153μg范圍內(nèi)質(zhì)量數(shù)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定原兒茶酸、原兒茶醛的峰面積，計(jì)算原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為0.22%、0.21%。實(shí)驗(yàn)表明儀器的精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液20μl，分別在0、6、10、16、22、25h各進(jìn)樣一次，測定原兒茶酸、原兒茶醛的峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為0.22%、0.21%。表明供試品溶液在25h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(130717)供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量分別為0.0211mg/g、0.0029mg/g，RSD分別為0.73%和1.23%(n=6)，表明此方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)分別取原兒茶醛和原兒茶醛對(duì)照品29.31mg和11.45mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5.00ml置500ml量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取同一批號(hào)(130717)的供試品5g，精密稱定，精密加對(duì)照品儲(chǔ)備液50ml，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，測定原兒茶酸、原兒茶醛的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1、2。測得原兒茶酸平均回收率97.01%，RSD=1.41%，原兒茶醛平均加樣回收率98.19%，RSD=1.82%。符合分析要求。

表2　原兒茶酸加樣回收結(jié)果

表3　原兒茶醛加樣回收結(jié)果

2.9樣品含量測定取5批樣品，按照供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件測定計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4　樣品中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定結(jié)果

3討論

3.1測定指標(biāo)選擇由金烏骨通膠囊的處方組成可知，要控制好該藥品質(zhì)量，必須控制好處方中主藥質(zhì)量，該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究中也以葛根、淫羊藿、姜黃、補(bǔ)骨脂等的活性成分測定，即葛根素、淫羊藿苷、姜黃素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等的含量測定來控制質(zhì)量[7]。金毛狗脊、木瓜中含有原兒茶酸和原兒茶醛也是該藥品功效活性成分，有必要開展原兒茶酸和原兒茶醛含量測定指標(biāo)，比文獻(xiàn)中采用薄層鑒別更好的控制該藥品質(zhì)量。

3.2檢測波長的選擇[8]取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含原兒茶酸、原兒茶醛分別為10μg/mL的溶液，搖勻，照紫外分光光度法(2010年版中國藥典一部附錄VA)，在190～500nm 處掃描，溶液在256、280、320nm的波長處均吸收波長處有最大吸收，考慮到該樣品成分復(fù)雜性；結(jié)合從DAD檢測器收集的圖譜信息可知，原兒茶酸最大吸收波長為(256±2)nm，原兒茶醛最大吸收波長為(280±2)nm。當(dāng)選擇280nm波長處測定，取樣量不變，則原兒茶酸幾乎檢測不到；而在256nm波長測定二者可兼顧，也不用增加取樣量，這樣減少對(duì)分析柱的污染，故選用256nm為檢測波長。

3.3流動(dòng)相的選擇[9-11]采用甲醇-冰醋酸(90∶10)和乙腈-冰醋酸(95∶5)，試驗(yàn)結(jié)果表明兩者均能達(dá)到分離效果，但由于該品種成分復(fù)雜，用單一的洗脫方式可以把原兒茶酸原兒茶醛分離，但對(duì)第二次進(jìn)樣干擾嚴(yán)重，為了消除相互干擾，采用梯度洗脫增加有機(jī)相洗脫殘留成分，所以本方法采用甲醇-乙腈-1%冰醋酸按表1梯度洗脫達(dá)到消除進(jìn)樣之間的相互干擾。

3.4提取方法的考察精密稱取樣品5g，加50ml乙酸乙酯提取，精密稱重，比較回流提15、30、60min的三個(gè)提取時(shí)間段，均用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足重量，濾過，取濾液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并轉(zhuǎn)移置5ml量瓶中，用1%的冰醋酸定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，結(jié)果表明，提取15min含量偏低，30、60min含量無明顯變化，為了省時(shí)采取回流30min。提取溶劑的選擇，比較甲醇乙醇提取溶劑，甲醇提取液顏色深，成分復(fù)雜，影響結(jié)果并易損壞色譜柱，乙醇提取含量偏低，故采用乙酸乙酯提取成分相對(duì)單一，便于分離檢測。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該檢測方法可以測定本品中原兒茶酸、原兒茶醛含量，具操作簡便、靈敏度高、能夠更好的克服其它物質(zhì)的干擾、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以有效的控制金烏骨通膠囊中金毛狗脊和木瓜藥材的質(zhì)量。

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(收稿日期：2015.12.27)

【中圖分類號(hào)】R284.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)04-0029-02

作者簡介：萬紅才(1977-)，男，貴州甕安人，主管藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)。E-mail：397879050@qq.com通信作者：段萍(1964-)，四川渠縣人，副主任藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)。E-mail：DuanPing1964@qq.com

基金項(xiàng)目：2011-2012年度國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高研究課題基金(530)。