付開聰 　崔明筠　周　兵

云南省普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南　普洱　665000

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哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

付開聰 崔明筠周兵

云南省普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南普洱665000

【摘要】目的：建立哈尼藥銅錘白花片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法(TLC)定性鑒別三七、獨(dú)活和白芍，采用高效液相色譜法(HPLC)測定制劑中龍血素b的含量。結(jié)果：TLC法能定性檢出三七、獨(dú)活和白芍，斑點(diǎn)清晰，且陰性對照無干擾；HPLC法測定龍血素b，進(jìn)樣量在0.031～0.157μg，龍血素b峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.998)，平均回收率98.42%(RSD 0.82%)。結(jié)論：所建標(biāo)準(zhǔn)簡便可行，穩(wěn)定性好，可用于哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】銅錘白花片；薄層色譜法；高效液相色譜法；龍血素b

銅錘白花片來源于云南哈尼族民間，主要用于治療治腰椎間盤突出癥、腰椎間盤突出癥引起的腰腿疼痛等癥狀，本方在普洱市民族醫(yī)院臨床使用多年，療效顯著。該方由銅錘草、白花丹、龍血竭和三七等十九味藥組成，臨床上以湯藥使用，為方便患者儲存、攜帶和服用，將其劑型改為片劑。為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床療效，采用薄層色譜法鑒別方中的三七、獨(dú)活和白芍，高效液相色譜法測定方中的有效成分龍血素b，為銅錘白花片的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1儀器Waters 1525 HPLC 儀(美國Waters公司)；KQ250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AG135十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Scanner-3薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG公司)。

1.2試藥銅錘白花片(規(guī)格0.5g/片，北京師范大學(xué)制備，批號20140815，20140816，20140817)；龍血素b(批號111558-201407)；人參皂苷R1(批號110703-200424)；芍藥苷(批號110736-201438)；獨(dú)活對照藥材(批號1200940-201111)；均購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純；硅膠板(青島海洋化工廠分廠)。

2方法與結(jié)果

2.1銅錘白花片的制備將銅錘草、三七、龍血竭、蜈蚣等藥材粉碎成細(xì)粉，備用，白花丹、獨(dú)活、牛膝、桂枝、燈盞花、當(dāng)歸、白芍等藥材加水煮提三次，第一次加10倍量水浸泡2h，煮沸2h，第二次加8倍量水，煮沸1h，第三次加8倍量水，煮沸1h，合并濾液，濃縮成稠膏狀后加入備用細(xì)粉攪拌均勻，制粒，整粒，壓片，即得。

2.2薄層色譜鑒別[1-3]

2.2.1三七的鑒別取銅錘白花片5g，研碎，粉末加乙醇50ml，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?ml乙醇溶解，作為供試品溶液；再取人參皂苷R1對照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；按供試品制備方法制得缺少三七樣品的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上。分液漏斗中加入三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合溶液，比例為7.5∶20∶11∶5，置10 ℃以下放置，取下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液為顯色劑，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈(365nm)下檢視，銅錘白花片供試品與人參皂苷R1對照品在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

2.2.2獨(dú)活的鑒別取銅錘白花片5g，研碎，粉末加乙酸乙酯50ml，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?ml乙酸乙酯溶解，備用；取獨(dú)活對照藥材加甲醇25ml，超聲30min，濾過，濾液濃縮至1ml的溶液，作為對照品溶液；按銅錘白花片供試品制備方法制得缺少獨(dú)活樣品的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯(2∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光燈(365nm)下檢視。銅錘白花片供試品與對照藥材在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。2.2.3白芍的鑒別取銅錘白花片5g，研碎，粉末加甲醇5ml，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?ml甲醇溶解，作為供試品溶液；對照品溶液取適量芍藥苷，加甲醇制成1ml含1mg芍藥苷的溶液；除去白芍樣品，按銅錘白花片供試品制備方法制得的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干， 5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。銅錘白花片供試品與對芍藥苷在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖3。

2.3龍血素b含量測定

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[4-8]色譜柱為 Waters XTerra@RP18 C18柱(3.9mm×150mm， 5μm)；乙腈-1%乙酸水溶液(37∶63)；檢測波長275nm，流速1.0ml·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量10μl。理論塔板數(shù)按龍血素b峰計(jì)算不低于10000。

2.3.2對照品溶液的制備取對照品龍血素b10.48mg，精密稱定，置100ml量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻, 精密量取適量,加甲醇稀釋成10.48μg·ml-1的溶液。

2.3.3供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)3.5g，精密稱定，精密加入甲醇100ml，稱定重量，超聲提取30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4陰性液的制備按處方比例稱取除去龍血竭的其他藥材適量,依照銅錘白花片的制備工藝制得陰性樣品,照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3.5線性關(guān)系的考察自動精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的龍血素b對照品溶液3、5、8、10、13、15μl，按色譜條件測定樣品溶液中龍血素b的含量，以龍血素b對照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=40721X-13550,R2=0.998。結(jié)果表明, 龍血素b進(jìn)樣量在0.031～0.157μg,龍血素b峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.6精密度試驗(yàn)取“2.3.2”項(xiàng)下的龍血素b對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果RSD為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.7重復(fù)性試驗(yàn)取6份樣品(批號：20140815),分別按色譜條件操作,測定龍血素b含量。結(jié)果龍血素b的含量均值為254.75μg·ml-1，RSD為1.42%，表明本方法重復(fù)性好。

2.3.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(批號：20140815測定)， 按0、2、4、6、8、12h時間間隔,分別測定龍血素b峰面積。結(jié)果,RSD為1.87%，供試品溶液制備后12 h內(nèi)測定,色譜峰面積無明顯變化,在此時間內(nèi)測定銅錘白花片樣品溶液，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3.9加樣回收試驗(yàn)取已知準(zhǔn)確含量的銅錘白花片樣品(批號：20140815),精密稱定，加入濃度為0.1048mg·ml-1的龍血素b對照品溶液4.3ml,定容至100ml, 稱定重量，超聲提取30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按色譜條件操作, 測定龍血素b含量。結(jié)果見表1。

2.3.10樣品測定取 3批銅錘白花片適量，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算樣品中龍血素b的含量分別為0.1750、0.182、0.183mg/片。

3討論

銅錘白花片為云南省普洱市哈尼族的傳統(tǒng)藥方，具有治療治腰椎間盤突出癥、腰椎間盤膨出癥引起的腰腿疼痛癥狀的功效，有豐富的臨床使用數(shù)據(jù)，使用年限超過10年。為了更好的服務(wù)患者，保護(hù)民族民間醫(yī)藥，傳承民族醫(yī)藥文化，普洱市民族醫(yī)院對銅錘白花片進(jìn)行質(zhì)量控制研究。

表1　銅錘白花片中龍血素b加樣回收試驗(yàn)

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、臨床服用方式、以及療效數(shù)據(jù)顯示，提取過程采取了加水煎煮的提取工藝[9-10]；方中三七、獨(dú)活、白芍采用TLC 法鑒別，簡便，快速，且無陰性干擾。通過紫外分光光度法對龍血素b對照品溶液在200~400nm波長進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長為275nm，峰形佳，因此確定采用275nm作為檢測波長；實(shí)驗(yàn)過程中采用乙腈-1%乙酸水溶液(37∶63)作為流動相，理論塔板數(shù)63411，同時計(jì)算龍血素b與相鄰峰的分離度為2.9，符合定量分析要求；試驗(yàn)所建標(biāo)準(zhǔn)可用于哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量控制依據(jù)。

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(收稿日期：2015.12.28)

【中圖分類號】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)04-0019-02