劉建奇，齊歡歡，劉玉梅，楊富貴，張彥婷，周雨霞*，魏學(xué)鋒*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.金宇保靈生物制品有限公司，呼和浩特 010030)

口蹄疫O型滅活疫苗對(duì)不同母源抗體仔豬血清中抗體及細(xì)胞因子水平的影響

劉建奇1，齊歡歡1，劉玉梅2，楊富貴2，張彥婷2，周雨霞1*，魏學(xué)鋒2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.金宇保靈生物制品有限公司，呼和浩特 010030)

為了解不同母源抗體水平對(duì)仔豬免疫后抗體消長(zhǎng)的影響，以及免疫后細(xì)胞因子的變化，使用口蹄疫O型滅活疫苗對(duì)40頭初生仔豬進(jìn)行免疫，并于初次免疫后28 d二次免疫，采用液相阻斷ELISA方法檢測(cè)血清中抗體滴度,雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清IL-8和IL-12水平。結(jié)果顯示，母源抗體水平越高對(duì)于初次免疫后仔豬抗體影響越大；二次免疫后抗體水平可長(zhǎng)時(shí)間維持較高水平。初次免疫后14 d～28 d，血清中IL-8和IL-12水平上升極顯著(P<0.01)；二次免疫后14～28 d，IL-8水平上升極顯著(P<0.01)，IL-12水平上升不顯著(P>0.01)。試驗(yàn)表明，母源抗體水平是影響仔豬免疫后抗體消長(zhǎng)的因素之一；口蹄疫O型滅活疫苗能有效提高血清中IL-8和IL-12水平。

口蹄疫O型滅活苗；母源抗體；白細(xì)胞介素-8；白細(xì)胞介素-12

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的動(dòng)物疫病[1]，是嚴(yán)重制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的烈性傳染病之一[2]。目前我國(guó)流行3個(gè)血清型，分別為A型、O型以及Asia Ⅰ型。近年來(lái)，全國(guó)各地牛、豬、羊仍然發(fā)生以SEA(Mya98)毒株為主的O型口蹄疫[2-3]。

通常認(rèn)為機(jī)體抗FMDV感染的免疫反應(yīng)主要為中和抗體的作用，最后通過(guò)巨噬細(xì)胞的吞噬作用將病毒清除[4]，然而B(niǎo)arnett等[5]對(duì)緊急疫苗的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，豬接種緊急疫苗后體內(nèi)可一直檢測(cè)到高濃度的IL-6、IL-8及IL-12等細(xì)胞因子，Jacquelyn等[6]研究表明細(xì)胞因子在機(jī)體抗FMDV感染中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)展中國(guó)家主要的防控措施是通過(guò)疫苗免疫接種，現(xiàn)今使用最廣泛的是滅活疫苗，免疫效果良好[2]。為初步探究口蹄疫O型滅活苗的免疫機(jī)制，本試驗(yàn)用口蹄疫O型滅活苗免疫豬只，采用ELISA檢測(cè)了不同母源抗體水平豬只抗體消長(zhǎng)規(guī)律以及血清中細(xì)胞因子水平差異，以期為制定合理的免疫程序提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇免疫兩次口蹄疫O型滅活疫苗初產(chǎn)長(zhǎng)白豬所產(chǎn)仔豬50頭，購(gòu)自呼和浩特市某豬場(chǎng)。經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)前母豬抗體分別為1∶210、1∶27.5、1∶29.5、1∶28.5、1∶210。仔豬免疫前后經(jīng)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC檢測(cè)，結(jié)果均呈陰性。

1.1.2 疫苗和試劑盒 豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株+O/GX/09-7株，抗原含量6～10 μg/頭份，批號(hào)：5235014)和液相阻斷ELISA試劑由金宇保靈生物藥品有限公司提供。IL-8和IL-12檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于R&D公司，貨號(hào)分別為E-50030、E-50023。口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA試劑盒購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 50頭仔豬分為5組，1～4組為免疫組，分別于初生49 d、63 d、70 d和49 d初次免疫，此時(shí)母源抗體分別為1∶26.6、1∶24 .1、1∶26.2和1∶25.1。初次免疫28 d后二次免疫，免疫劑量為2 mL/頭份。5組為對(duì)照組，注射與疫苗劑量相同的生理鹽水。各組于初生10～15 d，間隔4～7 d采血，測(cè)定血清中抗體滴度及細(xì)胞因子水平。

1.2.1 抗體滴度的測(cè)定 各組動(dòng)物從13日齡開(kāi)始，每隔7 d采用液相阻斷ELISA法進(jìn)行一次血清中口蹄疫病毒抗體滴度的測(cè)定，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。以抗原抗體對(duì)照平均OD492nm的50%為臨界值，被檢血清稀釋孔OD492nm的值大于臨界值為陽(yáng)性孔，小于或等于臨界值為陰性孔，陽(yáng)性孔的值所對(duì)應(yīng)的臨界值為該份血清的抗體滴度。若臨界值處于兩個(gè)滴度之間，應(yīng)取中間值。

1.2.2 血清中細(xì)胞因子水平測(cè)定 分別采集各組動(dòng)物初次免疫前以及初次免疫后第14、28、42和56天的血清，采用雙抗體夾心法測(cè)定血清中IL-8和IL-12水平，具體方法參照IL-8和IL-12檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用spss17.0進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 仔豬抗體消長(zhǎng)規(guī)律 結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著仔豬日齡的增加，對(duì)照組抗體水平緩慢下降至1∶23以下；與初次免疫前相比，1組、3組和4組初次免疫時(shí)抗體滴度>1∶25，免疫后14 d抗體水平顯著上升(P<0.05)；2組初次免疫時(shí)抗體滴度<1∶25，免疫后7 d抗體水平上升極顯著(P<0.01)。所有免疫組二次免疫后抗體水平緩慢上升至1∶210以上，抗體會(huì)長(zhǎng)時(shí)間維持高水平。

圖1 口蹄疫O型滅活苗免疫后抗體消長(zhǎng)規(guī)律

2.2 免疫后血清中細(xì)胞因子結(jié)果

2.2.1 免疫后血清中IL-8濃度 結(jié)果見(jiàn)圖2。

與初免前相比，*代表P<0.05,**代表 P<0.01圖2 口蹄疫O型滅活苗對(duì)免疫仔豬血清中IL-8水平的影響

對(duì)照組IL-8水平變化不顯著。1組和2組初次免疫14 d后IL-8水平極顯著上升(P<0.01)，4組IL-8水平顯著上升(P<0.05)，3組初次免疫28 d后IL-8水平顯著上升(P<0.05)；1組、2組和4組二次免疫14 d后IL-8水平極顯著上升(P<0.01)，3組IL-8水平顯著上升(P<0.05)。綜上所述，各試驗(yàn)組在免疫后IL-8水平總體呈上升趨勢(shì)。

2.2.2 免疫后血清中IL-12濃度 結(jié)果見(jiàn)圖3。

與初免前相比，*代表P<0.05,**代表P<0.01圖3 口蹄疫O型滅活苗對(duì)免疫仔豬血清中IL-12水平的影響

對(duì)照組IL-12水平變化不顯著。1組、2組和4組初次免疫14 d后IL-12水平上升極顯著(P<0.01)，3組初次免疫28 d后IL-12水平上升極顯著(P<0.01)；二次免疫14 d后IL-12水平除2組極顯著上升(P<0.01)外各試驗(yàn)組變化不顯著。

3 討論與小結(jié)

高世杰等[8]對(duì)母源抗體對(duì)豬口蹄疫疫苗免疫應(yīng)答的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，母源抗體越高，對(duì)疫苗的免疫效果影響越大。母源抗體的存在既能保護(hù)幼齡動(dòng)物免于病原菌侵襲，又具有干擾疫苗免疫的副作用。本試驗(yàn)中，當(dāng)母源抗體滴度>1∶25，初次免疫后7 d抗體滴度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，14 d后抗體滴度顯著上升；當(dāng)機(jī)體母源抗體滴度<1∶25時(shí)，初次免疫后7 d抗體滴度可迅速上升，因?yàn)樵诔醮蚊庖吆螅冈纯贵w要中和疫苗中的抗原。張玉等[9]在對(duì)豬O型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)方法的研究中表明，血清FMDV特異性抗體滴度越高，保護(hù)率就越高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，初次免疫21 d后抗體滴度均大于1∶27；在二次免疫14～21 d后抗體滴度均大于1∶29，且各組間差異不顯著，并維持很長(zhǎng)一段時(shí)間。馮杰等[10]在豬口蹄疫O型滅活疫苗免疫效果的研究中顯示，在二次免疫后10 d抗體滴度為1∶26.26，30 d為1∶26.8，60 d為1∶26.6。機(jī)體中口蹄疫特異性抗體滴度≥1∶26，99%保護(hù)，抗體滴度在1∶22～1∶25.5，50%保護(hù)，抗體滴度≤1∶22，不保護(hù)[7]。綜上所述，接種疫苗時(shí)既要充分考慮母源抗體的干擾，也要考慮到保護(hù)率的高低，接種疫苗時(shí)母源抗體滴度不高于1∶27，會(huì)影響疫苗的作用，也不能低于1∶25，此時(shí)保護(hù)率較低，畜群存在感染的隱患。

Barnard等[11]對(duì)接種緊急疫苗得到臨床保護(hù)的豬只進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種疫苗后產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子；IL-12可促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖，刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[12],蔡虎等[13]對(duì)O型口蹄疫滅活苗研究中發(fā)現(xiàn)，接種疫苗后28 d，測(cè)定血清中IL-12含量后攻毒，被保護(hù)的豬只血清中IL-12水平上升極顯著，未被保護(hù)的豬只IL-12水平變化不顯著，說(shuō)明IL-12可能在機(jī)體抗口蹄疫病毒感染起到重要作用。本試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物血清中IL-8和IL-12含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，IL-8和IL-12均較免疫前顯著升高。Barnett等[14]在對(duì)緊急疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)接種緊急疫苗后可檢測(cè)到IL-8和IL-12等細(xì)胞因子。各組免疫后血清中細(xì)胞因子水平上升速率不盡一致，這可能是母源抗體對(duì)特異性抗原位點(diǎn)的“封閉”而阻止抗原位點(diǎn)與機(jī)體免疫細(xì)胞上的相關(guān)抗原受體結(jié)合[1,8]，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本研究表明，母源抗體是影響初次免疫后抗體滴度的因素；口蹄疫O型滅活苗可激發(fā)機(jī)體快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，免疫效果確實(shí)，有較長(zhǎng)的免疫持續(xù)期；能有效提高血清中IL-8和IL-12的含量。

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(編輯：李文平)

The Effect of Type O FMD Inactivate Vaccine on Antibody and Cytokine Levels in Serum of Piglets with Different Maternal Antibodies

LIU Jian-qi1, QI Huan-huan1, LIU Yu-mei2, YANG Fu-gui2, ZHANG Yan-ting2, ZHOU Yu-xia1*,WEI Xue-feng2*

(1.InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China; 2.JinyuBaolingBiologyScienceandTechnologyCo.Ltd,Hohhot010030,China)

In order to study the influence of different maternal antibody levels on the dynamics of antibody and the changes of cytokines after piglet immunization, type O FMD inactivate vaccine was used to immune 40 newly-born piglets, and second immunization on day 28 post primary immunity. The antibody titer in serum was detected by liquid-phase blocking ELISA, the levels of IL-8 and IL-12 in serum were detected by double antibody sandwich ELISA. Results show that the higher maternal antibody level was, the greater effect of antibody on piglets after first immunization, the antibody level can maintain a high level for a long time after booster immunity. 14 to 28 days after first immunity, the levels of IL-8 and IL-12 in serum are greatly significant (P<0.01); 14 days to 28 days after second immunity, the level of IL-8 is greatly significant (P<0.01); the increase of IL-12 level is not significant (P>0.05). Results show that maternal antibody level is one of influencing factors of the dynamics of antibody after piglet immunization; type O FMD inactivate vaccine can effectively enhance the levels of IL-8 and IL-12 in serum.

type O FMD inactivate vaccine; maternal antibody; IL-8; IL-12

劉建奇，碩士，從事口蹄疫疫苗的研究。

周雨霞，E-mail:zyx660829@163.com；魏學(xué)鋒，E-mail: weixuefeng@jinyubaoling.com.cn

2016-01-16

A

1002-1280 (2016) 05-0011-04

S858.2