李永利，李杰，許卓妮，王東輝，陳鷹

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203)

氟甲喹的波譜學(xué)數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)確證

李永利，李杰，許卓妮，王東輝，陳鷹

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203)

建立了一種儀器分析技術(shù)確證氟甲喹化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法。采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜、一維(1H、13C、DEPT)和二維(HSQC、HMBC、1H-1H COSY)核磁共振譜、熱重分析(TGA)、差示掃描量熱法(DSC)以及X—射線粉末衍射(PXRD)對(duì)氟甲喹進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。討論了紫外和紅外吸收特征峰，詳細(xì)歸屬了所有的1H-NMR和13C-NMR信號(hào)，并對(duì)熱分析(TGA/DSC)結(jié)果進(jìn)行了解析，確定了與晶型相關(guān)的不同衍射角的特征衍射峰。以上研究結(jié)果確證了氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

氟甲喹；波譜學(xué)；波譜特征；結(jié)構(gòu)確證

氟甲喹(Flumequine)化學(xué)名為9-氟-6,7-二氫-5-甲基-1-氧代-1H,5H-苯并(ij)喹嗪-2-羧酸，屬于第二代氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥，最早由Rinker實(shí)驗(yàn)室研制成功；主要作用機(jī)制在于抑制細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中所需DNA旋轉(zhuǎn)酶，阻斷細(xì)菌DNA的復(fù)制從而發(fā)揮快速殺菌作用[1]。氟甲喹屬于廣譜抗菌劑，殺菌能力強(qiáng)，主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的感染，尤其是大腸桿菌、支原體、嗜水氣單胞菌引起的畜、禽及水生動(dòng)物疾病[2]。由于氟甲喹具有安全性高和成本較低等特點(diǎn)，其在無(wú)公害養(yǎng)殖、畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品等產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛[3]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)于氟甲喹的化學(xué)合成[4]、抗菌活性[5]，和藥物代謝動(dòng)力學(xué)[6]等研究的報(bào)道, 但其完整的結(jié)構(gòu)解釋(UV、IR、NMR、XRPD等)尚未見(jiàn)報(bào)道。由于氟甲喹結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，為了確定氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)，本文首次采用紫外吸收光譜(UV)、紅外光譜(IR)、高分辨質(zhì)譜(HR-MS)、核磁共振(NMR)熱重分析( TGA)、差示掃描量熱法(DSC)、X—射線粉末衍射(PXRD) 技術(shù)，對(duì)氟甲喹進(jìn)行了比較全面的結(jié)構(gòu)表征。這些參數(shù)不僅可以確定氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還可用于確定化合物晶型，為氟甲喹的進(jìn)一步鑒定和檢測(cè)分析提供了依據(jù)，也為其質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 PerkinElmer Spotlight 300型傅立葉紅外光譜儀，PerkinElmer公司，美國(guó)；Varian NMR System 500MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀，Agilent公司，美國(guó)；Agilent 6224 Accurate-Mass TOF LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司，美國(guó)；PerkinElmer Lambda 25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，PerkinElmer公司，美國(guó)；Bruker X-射線衍射儀，Bruker公司，美國(guó)；Perkin Elmer Diamond DSC功率補(bǔ)償型差示掃描量熱儀，PerkinElmer公司，美國(guó)；Perkin Elmer PYRIS 1 TGA熱重分析儀，PerkinElmer公司，美國(guó)。

1.1.2 試劑 氘代二甲基亞砜，Sigma Aldrich公司，美國(guó)；色譜甲醇，Merck 公司，美國(guó)；其余試劑為分析純，試驗(yàn)用水為超純水(25℃時(shí)電阻率為18.2 MΩ·cm)。氟甲喹樣品為本實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)為150501，經(jīng)液相色譜法分析，純度大于99%，符合結(jié)構(gòu)鑒定要求，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 氟甲喹的分子結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜 測(cè)試的氟甲喹樣品濃度為10 μg/mL甲醇溶液，以甲醇做空白，波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm[7]。

1.2.2 紅外光譜 樣品制備方法為ATR (Attenuated Total Reflection)法，測(cè)定范圍為650～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次[7]。

1.2.3 質(zhì)譜 測(cè)試樣品溶液為5 μg/mL甲醇溶液，直接進(jìn)樣；離子源為電噴霧正離子源(ESI+)，錐孔電壓30 V，毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量400 L·h-1；錐孔氣流量50 L·h-1。

1.2.4 核磁共振譜 測(cè)試溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6，含內(nèi)標(biāo)TMS)，1H NMR的觀測(cè)頻率為499.77 MHz，13C NMR的觀測(cè)頻率為125.68 MHz；所有二維譜均為標(biāo)準(zhǔn)序列測(cè)定[8]。

1.2.5 熱分析和X—射線粉末衍射 熱重分析方法：鉑金盤(pán)，敞開(kāi)，掃描范圍為30℃～500℃，升溫速率為20℃/min，氮?dú)饬髁繛?0 mL·min-1。差示掃描量熱測(cè)試方法：鋁盤(pán)，不密封，掃描范圍為0 ℃～300 ℃，升溫速率為20 ℃/min，氮?dú)饬髁繛?0 mL·min-1[7]。X—射線粉末衍射方法：從3.000度 掃描到44.993度，步長(zhǎng)為0.020度，陽(yáng)極為Cu(40 kV, 30 mA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜 氟甲喹甲醇溶液的紫外光譜主要有3個(gè)吸收峰(λ1= 241 nm、λ2= 252 nm和λ3= 266 nm)，這些吸收峰是由π-π*躍遷產(chǎn)生的3個(gè)吸收帶[7]。這是由樣品結(jié)構(gòu)中芳香環(huán)共軛結(jié)構(gòu)引起的，表明該化合物存在芳香環(huán)結(jié)構(gòu)片段，與氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)相符。

2.2 紅外吸收光譜 氟甲喹的紅外光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1中伸縮振動(dòng)表示為ν，彎曲振動(dòng)表示為δ，強(qiáng)吸收、中等吸收和弱吸收分別以s、m和w表示。

表1 氟甲喹樣品的紅外光譜解析表

從紅外譜圖數(shù)據(jù)表1可知，3055、1565、1466、898和885 cm-1為樣品中共軛芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[8]， 2682和1721 cm-1為羧基的特征吸收峰[9]，1620 cm-1是與苯環(huán)共軛的酮羰基吸收峰[10]，1210和1066 cm-1是叔胺結(jié)構(gòu)片段的特征峰。在2991和1394 cm-1處的吸收峰，是甲基的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)峰，表明樣品結(jié)構(gòu)含有甲基[11]。由此說(shuō)明，樣品的紅外光譜與氟甲喹應(yīng)有的紅外光譜一致。

2.3 質(zhì)譜 對(duì)氟甲喹溶液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜(ESI-TOF-MS)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 氟甲喹的高分辨電噴霧質(zhì)譜圖

圖2中m/z262.0877是樣品的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，通過(guò)高分辨質(zhì)譜HRESIMS確定其分子式為C14H12FNO3，這與氟甲喹的分子式一致。

2.4 核磁共振波譜 核磁共振技術(shù)可以提供化合物細(xì)微結(jié)構(gòu)的信息，從而為結(jié)構(gòu)確證研究提供更多準(zhǔn)確可靠的信息[12]，本研究測(cè)試了樣品的一維和二維核磁數(shù)據(jù)。樣品的1H NMR見(jiàn)圖3，13C NMR見(jiàn)圖4，HSQC，HMBC及1H-1H COSY圖譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖3 氟甲喹的1H NMR圖譜

圖4 氟甲喹的13C NMR圖譜

1H NMR譜中，δH2.50為溶劑峰(DMSO峰)，δH3.34為殘留水峰。設(shè)定δH9.02的單重峰積分值為1，信號(hào)總積分為12，推斷樣品分子中氫原子數(shù)為12或12的整數(shù)倍。在圖譜高場(chǎng)區(qū)，質(zhì)子信號(hào)δH1.40 (d, 7.0)的積分值為3，耦合裂分為二重峰, 表明分子結(jié)構(gòu)中存在與次甲基相連的甲基；位于δH2.14、3.08、3.16的信號(hào)，根據(jù)其化學(xué)位移以及積分值信息，推測(cè)其應(yīng)為分子中的兩個(gè)亞甲基的吸收峰；化學(xué)位移δH4.94的吸收峰信號(hào)，則歸屬為與氮原子相連的次甲基。低場(chǎng)有四組質(zhì)子信號(hào)：δH7.74、7.81、9.02、15.11 ，其中前三組均為芳香環(huán)上的氫信號(hào)，δH15.11加D2O交換后消失，表明其為羧基上的氫。

13C NMR圖譜顯示14組碳信號(hào)，分別對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)中的14個(gè)碳原子，結(jié)合DEPT-135譜可確定結(jié)構(gòu)含有1個(gè)甲基、2個(gè)亞甲基、4個(gè)次甲基和7個(gè)季碳信號(hào)，其中δ165.9為羧基碳信號(hào)，δ176.9為酮羰基碳信號(hào)。在高場(chǎng)部分，δ20.0吸收峰對(duì)應(yīng)于甲基C-13；δ21.5，25.1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于亞甲基C-10和C-11；12位次甲基碳與電負(fù)性較強(qiáng)的N原子相連，信號(hào)向低場(chǎng)移動(dòng)，化學(xué)位移應(yīng)為δ57.4。在低場(chǎng)部分，δ107.9，121.7和147.4分別對(duì)應(yīng)于芳香環(huán)上的三個(gè)次甲基C-5、C-7和C-2，C-2因與N原子相連，化學(xué)位移偏向低場(chǎng)；δ159.1處吸收峰產(chǎn)生分裂，耦合常數(shù)J= 246 Hz，表明其為直接與F原子相連接的C-6，而C-5和C-7的吸收峰耦合常數(shù)也符合鄰位碳的裂分規(guī)律。

在HSQC譜中，可以看到13位甲基、10和11位兩個(gè)亞甲基、12位次甲基以及芳香環(huán)的三個(gè)氫H-2、H-5、H-7的碳?xì)湎嚓P(guān)信號(hào)(表2)。在HMBC譜中，H-2與酮羰基C-4、羧基C-9、次甲基C-12以及季碳C-3、C-8A相關(guān)；H-5與酮羰基C-4，芳香環(huán)碳C-6、C-7、C-8A相關(guān)；H-7與C-5、C-6、C-8A、C-10相關(guān)；亞甲基上氫H2-11與芳香環(huán)C-8、脂肪鏈上亞甲基C-10、次甲基C-12、甲基C-13存在相關(guān)信號(hào)。在1H-1H COSY譜中，可以提供1H-1H之間成鍵作用的相關(guān)信息，可以看到H2-10/H2-11/H-12/H3-13相關(guān)信號(hào)，表明脂肪鏈上的11位亞甲基與10位亞甲基、12位次甲基直接相鄰，12位次甲基與11位亞甲基、13位甲基直接相鄰。以上結(jié)果與氫譜、碳譜、DEPT和 HSQC譜的數(shù)據(jù)完全符合。1H-NMR、13C-NMR譜、HSQC、HMBC和1H-1H COSY 數(shù)據(jù)及歸屬見(jiàn)表2。

表2 氟甲喹樣品的核磁共振數(shù)據(jù)表

2.5 熱重分析(TGA) 、差示掃描量熱分析(DSC)和X-射線粉末衍射 TGA 測(cè)得樣品在溫度約為 248.77 ℃ 時(shí)開(kāi)始失重，在此之前隨溫度升高未發(fā)生失重現(xiàn)象，表明氟甲喹不含結(jié)晶水[13]，且所測(cè)樣品基本不含有吸附水與殘留溶劑。

DSC圖譜顯示樣品在252.62 ℃～255.39 ℃有1個(gè)熔化吸熱峰，在254.74 ℃時(shí)為最大吸熱點(diǎn)，且為單一特征吸熱峰。由此表明，氟甲喹樣品為單一晶型的結(jié)晶性粉末，隨溫度升高晶型穩(wěn)定，不存在轉(zhuǎn)晶現(xiàn)象。

X-射線粉末衍射測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。在X-射線粉末衍射圖譜中樣品具有尖銳的衍射極大，說(shuō)明氟甲喹樣品為一晶體物質(zhì)。

表3 樣品 X-射線粉末衍射測(cè)試數(shù)據(jù)

3 討論與小結(jié)

結(jié)構(gòu)確證要求原料的純度達(dá)到98%以上。因此，結(jié)構(gòu)確證應(yīng)首先測(cè)定原料的純度。通過(guò)液相色譜法的測(cè)試，表明氟甲喹原料符合結(jié)構(gòu)確證的純度要求。

高分辨率質(zhì)譜能精確到小數(shù)點(diǎn)后面4位，能給出精確分子量，從而給出分子式。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)樣品的高分辨質(zhì)譜測(cè)試，得到分子式C14H12FNO3，這和氟甲喹的分子式一致。樣品在紫外241、252和266 nm處有最大吸收，這與氟甲喹結(jié)構(gòu)中存在的芳香環(huán)片段相符合。紅外光譜顯示，樣品在1565和1466 cm-1存在強(qiáng)吸收，也對(duì)應(yīng)于前面的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，1721 和1620 cm-1處的強(qiáng)吸收分別對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)中羧基的特征吸收峰以及與苯環(huán)共軛的酮羰基吸收峰。這些特征均與氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。

核磁共振碳譜測(cè)試需要樣品的濃度較高(一般20～50 mg樣品溶于0.5 mL氘代溶劑)，而喹諾酮類(lèi)化合物在常規(guī)氘代溶劑(D2O、CD3OD、CDCl3、CD3COCD3)中溶解度較小，造成在這些溶劑中的碳譜信號(hào)很少導(dǎo)致無(wú)法解析。經(jīng)過(guò)測(cè)試發(fā)現(xiàn)在氘代二甲基亞砜中溶解度雖然稍好但還是偏低，故在測(cè)試前先加熱促進(jìn)溶解，再進(jìn)行核磁測(cè)試，最終得到高質(zhì)量的核磁信號(hào)。在此基礎(chǔ)上，首次對(duì)氟甲喹的1H 和13C NMR信號(hào)進(jìn)行了詳細(xì)的解釋?zhuān)_定目標(biāo)化合物的一維核磁數(shù)據(jù)與氟甲喹的分子結(jié)構(gòu)式一致，二維譜的解析進(jìn)一步確證了氟甲喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

本文首次報(bào)道了X-射線粉末衍射特征衍射峰特征，在反射角2θ為10.006、10.300、11.150、16.833、20.050、22.457、25.339、26.402、27.747、34.337處有特征峰，進(jìn)一步為該藥物生產(chǎn)中的質(zhì)量控制提供了重要的參考依據(jù)。

綜上所述，本工作通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜等波譜學(xué)的研究可以確定目標(biāo)化合物就是氟甲喹。X射線粉末衍射分析確定該樣品呈結(jié)晶狀態(tài)，給出了衍射角度、晶面距、相對(duì)豐度等晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)。該方法可以作為氟甲喹的結(jié)構(gòu)確證方法，也為此類(lèi)化合物的定性以及結(jié)構(gòu)解析提供了客觀的分析依據(jù)。

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(編輯：陳希)

Spectral Analysis and Structural Confirmation of Flumequine

LI Yong-li，LI Jie，XU Zhuo-ni， WANG Dong-Hui，CHEN Ying

(ShanghaiInstituteofMeasurementandTestingTechnology,Shanghai201203,China)

A method for determination of chemical structure of flumequine was established. The structure was elucidated by UV, IR, MS, 1D NMR (1H,13C, DEPT) and 2D NMR (HSQC, HMBC,1H-1H COSY), DSC, TGA, and PXRD. The UV and IR absorption peaks were discussed, and all the signals of1H-NMR and13C NMR were attributed to their respective structures and positions in the molecule. The test result of TGA /DSC was analyzed，and the diffraction peaks of the different diffraction angles related to the crystal form were determined．The experiment verified that the chemical structure of this compound is flumequine.

flumequine; spectroscopy; spectroscopic characteristic; structure confirmation

上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對(duì)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(14TBT007；15TBT009)

李永利，博士，工程師，從事天然藥物及有機(jī)分析相關(guān)研究。E-mail: jinchi333@126.com

2016-03-16

A

1002-1280 (2016) 05-0029-05

R917