邵靜，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

精子和卵子結(jié)合形成的受精卵拉開了早期胚胎發(fā)育的序幕，可是只有當(dāng)胚胎真正繼承了雙親的遺傳物質(zhì)，生命才算正式開始，這一刻被稱為合子基因組激活（zygotic genome activation,ZGA）。ZGA是胚胎著床前的關(guān)鍵時(shí)期，也是決定胚胎能否繼續(xù)發(fā)育的重要階段，甚至影響到原腸胚的形成和早期胚胎分化[1]。受精卵發(fā)育的第一步就是將兩個(gè)終末分化的配子重新編程為全能胚胎[2]。但是在受精早期，雌、雄原核融合的合子核基因組處于轉(zhuǎn)錄靜止?fàn)顟B(tài)，無法合成蛋白質(zhì)，胚胎的早期發(fā)育完全由卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存的母源因子（mRNA和蛋白質(zhì)）控制。母源因子是維持受精后第一次卵裂的必要物質(zhì)，可以驅(qū)動(dòng)早期胚胎快速地進(jìn)行有絲分裂[3]。但隨著母源因子被逐漸消耗和降解，胚胎需要依靠自身物質(zhì)來繼續(xù)發(fā)育，胚胎發(fā)育由母源轉(zhuǎn)錄本調(diào)控轉(zhuǎn)變?yōu)橛珊献雍嘶蚪M調(diào)控，這一過程就是母源-合子轉(zhuǎn)換（maternal-to-zygotic Transition，MZT）[4]。ZGA和母源因子的清除協(xié)調(diào)作用，共同完成了MZT，使胚胎獲得能夠分化成完整個(gè)體的全能性。由于MZT在早期胚胎發(fā)育中存在關(guān)鍵作用，有關(guān)母源因子清除和ZGA發(fā)生機(jī)制的研究一直備受干細(xì)胞生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域研究者的關(guān)注。雖然ZGA在后生動(dòng)物中普遍存在，但不同物種中ZGA的發(fā)生時(shí)間存在差異。小鼠胚胎基因組激活發(fā)生在2-細(xì)胞胚胎晚期[5]；大型家畜的早期胚胎發(fā)育通常更依賴母源因子，例如豬和牛的ZGA發(fā)生在4-細(xì)胞到16-細(xì)胞之間[6,7]；人類胚胎基因組的轉(zhuǎn)錄激活一般在4-細(xì)胞和8-細(xì)胞時(shí)期[8-10]。

小分子非編碼RNA（small non-coding RNA，sncRNA）是一類長度僅為20-30 nt的非編碼RNA，過去曾被認(rèn)為是“垃圾DNA”的非功能性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、與PIWI蛋白相互作用的RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）和小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）[11]。但深入研究發(fā)現(xiàn)，這些sncRNA可以在RNA干擾（RNAi）中發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與多種生命活動(dòng)，例如生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡和各種疾病發(fā)生[12,13]。也有研究認(rèn)為sncRNAs能夠定向調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，在早期胚胎中激活或產(chǎn)生清除母源因子的信號(hào)通路，參與母源轉(zhuǎn)錄本的降解，使胚胎能夠順利完成母源因子的清除和合子基因組的激活，從而將卵母細(xì)胞對早期胚胎的發(fā)育控制權(quán)轉(zhuǎn)向合子基因組[14]。本文總結(jié)了近年來sncRNA參與母源因子清除的主要研究進(jìn)展，綜述sncRNA調(diào)節(jié)MZT的研究現(xiàn)狀。

1 母源因子降解對合子基因組激活的作用

1.1 母源因子的定義

精子和卵子結(jié)合所形成的受精卵是個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)，但事實(shí)上受精卵是由雌雄原核融合的合子核以及卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)組成。在卵裂初期，合子基因組沒有表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中儲(chǔ)存的RNA和蛋白質(zhì)控制著早期胚胎的有絲分裂，這些物質(zhì)被稱為母源因子，負(fù)責(zé)表達(dá)母源因子的基因則為母源基因。胚胎早期發(fā)育完全依賴于母源因子。Motley是斑馬魚胚胎中的母源因子，控制染色體的分離和細(xì)胞質(zhì)的分裂，Motley突變后胚胎中的染色體排列異常，細(xì)胞質(zhì)分裂不均勻[15]。合子阻滯基因1（Zygote arrest 1，Zar1）是最早被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控早期胚胎發(fā)育的母源基因，Zar1基因缺失會(huì)導(dǎo)致雌鼠不育，受精卵缺失Zar1基因則會(huì)在1-細(xì)胞階段停止發(fā)育[16]。但隨著胚胎發(fā)育越來越復(fù)雜，胚胎需要激活自身的基因組才能成長為新個(gè)體，母源因子逐漸消耗并被清除。

1.2 母源因子降解是合子基因組激活的前提

在母源因子主導(dǎo)胚胎基因組轉(zhuǎn)變的過程中，絕大多數(shù)母源因子都會(huì)降解，母源因子及時(shí)降解是保障合子基因組完成激活和胚胎繼續(xù)發(fā)育的前提。一部分母源mRNA在ZGA之前甚至在受精之前就被母源物質(zhì)清除，屬于母源性降解（Maternal decay，M-decay）；還有一些母源mRNA需要在部分合子基因表達(dá)之后被胚胎產(chǎn)物降解，稱為合子性降解（Zygotic decay，Z-decay）[17]。果蠅有1/3的合子核基因可能會(huì)促使母源mRNA降解[18]。小鼠中絕大多數(shù)母源mRNA都在2-細(xì)胞期后降解，BTG4基因只在卵母細(xì)胞和受精卵中表達(dá)，敲除BTG4的小鼠卵母細(xì)胞雖然具備受精能力但只能發(fā)育到2-細(xì)胞，并且本該降解掉的母源mRNA仍然存在[19]。敲除小鼠卵母細(xì)胞中調(diào)控DNA甲基化的Stella基因后有一半的胚胎由于ZGA缺陷而不能發(fā)育到4-細(xì)胞[20]。人類胚胎普遍在8-細(xì)胞發(fā)生ZGA，如果母源mRNA沒有及時(shí)清除，胚胎發(fā)育會(huì)受到阻礙，胚胎基因組也不會(huì)表達(dá)[21]。在正常斑馬魚胚胎中，YTHDF2會(huì)識(shí)別母源mRNA的m6A甲基化修飾并使mRNA降解，敲除YTHDF2后母源mRNA的半衰期延長，原腸胚形成時(shí)間推遲，注射外源YTHDF2則會(huì)使表型恢復(fù)正常[22]。山羊胚胎也有類似的現(xiàn)象，ZGA過程中YTHDF2呈高水平表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組測序顯示母源mRNA的含量在ZGA之前都呈現(xiàn)下降的趨勢，敲除YTHDF2后脫帽酶DCP1A的表達(dá)量下調(diào)，母源mRNA不能完全降解，很多胚胎沒有發(fā)育成囊胚[23]。綜上，母源因子在早期胚胎發(fā)育中起到?jīng)Q定作用，在MZT階段，母源因子能否正常降解調(diào)控著合子基因組的激活時(shí)間以及胚胎的發(fā)育速度。

2 miRNA

2.1 miRNA的作用機(jī)制

miRNA是較早被發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，從此掀起了傳統(tǒng)中心法則之外的非編碼RNA功能機(jī)制的研究熱潮。miRNA廣泛存在于動(dòng)物的各個(gè)組織中，哺乳動(dòng)物約半數(shù)的基因表達(dá)都會(huì)受到miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA與靶基因并不是一一對應(yīng)的，一個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也可以受到很多miRNA的調(diào)節(jié)，因此形成了復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[24]。與其他RNA一樣，miRNA也是由細(xì)胞核內(nèi)的DNA轉(zhuǎn)錄而來。如圖1所示，miRNA基因在聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄成初級miRNA（pri-miRNA）[25]。DGCR8識(shí)別pri-miRNA并與Drosha酶形成復(fù)合物將pri-miRNA分解為只有70~80 nt的前體miRNA（pre-miRNA）[26]。pre-miRNA經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核外，被細(xì)胞質(zhì)中的RNA內(nèi)切酶III家族的Dicer酶切割成20 nt左右的雙鏈miRNA，在AGO2蛋白的共同作用下將雙鏈打開，暴露出其中的引導(dǎo)鏈，引導(dǎo)鏈與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）結(jié)合，引導(dǎo)成熟的miRNA與調(diào)節(jié)靶基因穩(wěn)定性的3'UTR結(jié)合，抑制靶基因的翻譯[27]。

圖1 miRNA的生物形成及作用機(jī)制[28]Fig.1 The biogenesis and action mechanism of miRNA[28]

2.2 miRNA與ZGA期間降解母源因子

miRNA是胚胎發(fā)育從母源因子調(diào)控轉(zhuǎn)變成合子基因組調(diào)控的主要參與者。這些小分子內(nèi)源性非編碼RNA在卵巢組織、顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞、卵泡液和胚胎中表達(dá)，有些miRNA還可以經(jīng)囊泡排到胞外，與細(xì)胞內(nèi)的miRNA共同參與生物體生存和發(fā)育的調(diào)節(jié)[29]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，降低果蠅AGO1基因表達(dá)會(huì)使胚胎發(fā)育停滯，還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[30]；AGO2蛋白參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的形成，缺失該蛋白后，小鼠胚胎不能正常發(fā)育成原腸胚[31]；DGCR8是miRNA加工過程中的重要蛋白，敲除DGCR8基因后小鼠胚胎只能短暫發(fā)育到6.5 d[32]；無獨(dú)有偶，小鼠早期胚胎缺失Dicer基因后往往在原腸胚前后停止發(fā)育[33]，這些結(jié)果都表明早期胚胎的發(fā)育一定要有miRNA的存在。

miRNA主要參與母源因子的合子性降解通路。miR-430在斑馬魚早期胚胎中廣泛表達(dá)，屬于第一批被合子基因表達(dá)的miRNA。斑馬魚的很多母源mRNA都受到miR-430的調(diào)節(jié)，而miR-430的多數(shù)靶基因也都屬于母源mRNA，早期胚胎缺失miR-430會(huì)導(dǎo)致上百個(gè)母源mRNA的表達(dá)不能被充分抑制，缺乏Dicer的斑馬魚胚胎在形成原腸胚的過程中會(huì)出現(xiàn)阻礙，但通過注射miR-430可以彌補(bǔ)這種阻礙繼續(xù)發(fā)育，說明miR-430主要在ZGA階段起作用[34]。Nanog、Pou5f1和SoxB1是來自卵母細(xì)胞的高度表達(dá)的母源轉(zhuǎn)錄因子，通過激活miR-430的表達(dá)清除母源因子并調(diào)節(jié)ZGA，缺失這種基因的斑馬魚胚胎則不能發(fā)育成原腸胚，包括miR-430在內(nèi)的半數(shù)合子基因也無法激活[35,36]。miR-309簇編碼的8個(gè)miRNA（miR-3、miR-4、miR-5、miR-6-1、miR-6-2、miR-6-3、miR-286和miR-309），在果蠅胚胎的合子基因組開始轉(zhuǎn)錄時(shí)也會(huì)被表達(dá)出來，敲除miR-309簇后母源mRNA顯著上調(diào)，證明這些miRNA可以在清除果蠅胚胎母源因子中發(fā)揮作用[37]。RNA結(jié)合蛋白Smaug（SMG）屬于母源性降解通路，可以與果蠅胚胎中的母源轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，在脫腺苷酸化酶復(fù)合體的作用下降解母源因子[38]，也能夠促進(jìn)miR-309簇的表達(dá)，將SMG突變后miR-309等8個(gè)miRNA的表達(dá)量明顯降低，而母源因子的含量卻沒有明顯下降[39]。與miR-430類似，miR-427是由非洲爪蟾胚胎基因組表達(dá)的miRNA，在受精7 h后就可以檢測到很高的豐度，但在原腸胚形成后會(huì)迅速減少，在成年的非洲爪蟾中不會(huì)再表達(dá)[40]。非洲爪蟾合子基因組激活前依賴母源性細(xì)胞周期蛋白A1和B1進(jìn)行快速地卵裂，但miR-427靶向表達(dá)母源性細(xì)胞周期蛋白的轉(zhuǎn)錄本的3'UTR，使母源性細(xì)胞周期蛋白逐漸衰減，促使合子基因表達(dá)，為胚胎提供新的細(xì)胞周期蛋白，并且非洲爪蟾的很多母源性mRNA都存在miR-427的潛在靶位點(diǎn)，這表明miR-427可能是降低母源mRNA表達(dá)的重要參與者[41]。線蟲中有miR-35-42和miR-51-56可以誘導(dǎo)母源mRNA脫腺苷酸化來降解母源因子[42]。

小鼠的合子基因在2-細(xì)胞晚期開始表達(dá)的同時(shí)，miR-290-295簇也在第一時(shí)間被編碼形成，并且在4-細(xì)胞時(shí)期轉(zhuǎn)錄速度加快，在這之前胚胎中都只有少量的miR-290-295[43]。分析小鼠不同時(shí)期胚胎的基因表達(dá)譜，與miRNA作用機(jī)制相關(guān)的AGO2基因的表達(dá)量在不同的胚胎時(shí)期有很大的波動(dòng)，2-細(xì)胞胚胎表達(dá)量下降了5倍，但在4-細(xì)胞和8-細(xì)胞期又恢復(fù)到高水平，到桑葚胚時(shí)期迅速下降[44]。在牛的早期胚胎中，miR-125、miR-127和miR-145的表達(dá)量在4-細(xì)胞和8-細(xì)胞時(shí)期升高[45]，miR-130a和miR-21的表達(dá)量在8-細(xì)胞時(shí)期增加[46]。雞的miR-302家族是小鼠的miR-290家族、非洲爪蟾的miR-427家族以及斑馬魚的miR-430家族的直系同源物，在卵裂中后期（EGK.VIII期）表達(dá)量大幅度增加，并在胚盤期（EGK.X期，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的囊胚期）大量表達(dá)[47,48]，這種動(dòng)態(tài)的表達(dá)模式也可能是miRNA能夠調(diào)節(jié)MZT的一種體現(xiàn)。

多能性因子OCT4、Nanog、SOX2和KLF4有調(diào)節(jié)合子基因組激活的作用，OCT4是人類ZGA必要的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)合位點(diǎn)富集在ZGA時(shí)期的染色質(zhì)開放區(qū)域[49]。將miR-294與OCT4、SOX2和KLF4外源基因共同導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，可以讓細(xì)胞的重編程效率比沒有轉(zhuǎn)染miR-294的細(xì)胞高10倍[50]。在沒有誘導(dǎo)多能性的外源轉(zhuǎn)錄因子的情況下轉(zhuǎn)染miR-302仍然能使人或小鼠的成纖維細(xì)胞重編程為多能細(xì)胞[51]。NOBOX是在牛早期胚胎發(fā)育中起作用的母源基因，miR-196a能夠靶向NOBOX的3'UTR區(qū)域在MZT期間清除這種母源因子，可以檢測到NOBOX表達(dá)量在8-細(xì)胞期迅速降低，miR-196a的表達(dá)量增加的時(shí)期和胚胎基因組激活的時(shí)間是一致的[52]。SEBOX是一種母體效應(yīng)基因，一直到小鼠的ZGA之前都有很高的表達(dá)量，該基因被敲除后不會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育，但原核期胚胎缺失SEBOX則會(huì)使母源因子不能完全降解以及調(diào)控ZGA的基因異常表達(dá)，從而導(dǎo)致2-細(xì)胞胚胎發(fā)育受阻[53]。研究發(fā)現(xiàn)敲除miR-125家族會(huì)增加SEBOX的表達(dá)量，并導(dǎo)致在MZT期間調(diào)控ZGA基因的表達(dá)量上升[54]。胚胎也可以通過攝取子宮內(nèi)膜的miRNA激活相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)著床時(shí)間，例如子宮內(nèi)膜的miR-30d可以間接觸發(fā)與人類胚胎粘附相關(guān)的基因的表達(dá)[55]。

現(xiàn)階段關(guān)于miRNA對ZGA的研究大多集中在胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析，miRNA在卵母細(xì)胞和不同時(shí)期的胚胎中差異表達(dá)也是miRNA能夠在早期胚胎發(fā)育過程中起調(diào)節(jié)作用的依據(jù)之一。miRNA主要通過抑制母體效應(yīng)基因的翻譯，降低母源轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，加速母源因子的降解等途徑清除母源因子。目前，miRNA對MZT和ZGA的作用只在昆蟲和斑馬魚等脊椎動(dòng)物中得到了明確的驗(yàn)證，在哺乳動(dòng)物中的實(shí)際作用效果還需要進(jìn)一步探究。miRNA只是小分子非編碼RNA的一個(gè)分支，并不能完全代表sncRNAs在ZGA過程中的功能機(jī)制。

3 siRNA

3.1 siRNA的作用機(jī)制

siRNA也是RNA干擾的主要途徑之一，在基因表達(dá)的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。與miRNA類似，內(nèi)源性siRNA（endo-siRNA）的形成也需要在Dicer酶的作用下將機(jī)體內(nèi)部產(chǎn)生的具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）切割成長度為21~25 bp的雙鏈小RNA片段[56]。成熟的endo-siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)是siRNA發(fā)揮RNA干擾功能的前提條件。如圖2所示，endo-siRNA中的隨從鏈被分離降解，引導(dǎo)鏈與Argonaute家族的AGO2蛋白結(jié)合構(gòu)成RISC，與mRNA結(jié)合誘導(dǎo)靶基因降解[57]。相比于miRNA，endo-siRNA對于靶基因具有更高的特異性識(shí)別能力。endo-siRNA可以靶向mRNA的任何區(qū)域而不局限在非編碼區(qū)，miRNA只需要種子序列的7個(gè)堿基與靶位點(diǎn)結(jié)合便可以抑制mRNA的翻譯，而siRNA的序列則需要與靶基因完全匹配才能使用RISC中的核酸內(nèi)切酶切斷結(jié)合位點(diǎn)處的mRNA，被切斷的mRNA迅速被細(xì)胞中的酶降解，不能再進(jìn)行下一步的翻譯表達(dá)[58]。生物體中的endo-siRNA大多分布在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的假基因、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)座子區(qū)域[59]。siRNA現(xiàn)已成為分子和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不可或缺的工具。研究人員利用siRNA的這一作用機(jī)理，通過簡單的轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源的siRNA導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)對象中，實(shí)現(xiàn)基因的敲除，以此進(jìn)行疾病防治、新藥開發(fā)以及基因診斷等不同領(lǐng)域的研究。雖然siRNA在生物體中的很多調(diào)節(jié)機(jī)制都不明確，但由于siRNA與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本結(jié)合的特異性高于miRNA，對mRNA的降解能力也更強(qiáng)，所以目前siRNA作為基因敲除工具在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有比miRNA更廣泛的應(yīng)用。

圖2 siRNA的作用機(jī)制[60]Fig.2 The action mechanism of siRNA[60]

3.2 siRNA與母源因子的降解

endo-siRNA在卵母細(xì)胞中高度表達(dá)，已有報(bào)道顯示siRNA能夠調(diào)節(jié)早期胚胎的發(fā)育過程。卵母細(xì)胞儲(chǔ)存的大部分母源因子一方面可以調(diào)控卵母細(xì)胞順利進(jìn)入減數(shù)第二次分裂中期，使其擁有受精能力，另一方面又可以在早期胚胎中表達(dá)，支持胚胎前期的卵裂，所以母源因子的缺失和突變都可能造成雌性動(dòng)物的不孕或流產(chǎn)[19,61]。將小鼠卵母細(xì)胞中的Dicer基因敲除后，紡錘體的形成受阻，同源染色體也不能正常分離，卵母細(xì)胞的發(fā)育將停滯在第一次減數(shù)分裂，導(dǎo)致小鼠不能受精[62]；存在于卵母細(xì)胞中的miRNA和endo-siRNA需要在Dicer酶的參與下才能形成。Suh等[63]敲除小鼠卵母細(xì)胞中的DGCR8基因后，細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，卵母細(xì)胞仍然可以發(fā)育成熟，并能與精子結(jié)合產(chǎn)生正常的受精卵。由于siRNA的形成過程中不需要DGCR8蛋白的調(diào)節(jié)，DGCR8基因的缺失只能抑制卵母細(xì)胞中miRNA的生成，說明endo-siRNA是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟以及動(dòng)物生育不可缺少的調(diào)節(jié)因子。Stein等[64]進(jìn)行卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA的活性在卵母細(xì)胞發(fā)育的過程中始終受到抑制，這也說明miRNA在卵母細(xì)胞生長過程中幾乎不發(fā)揮作用。

抑制相關(guān)miRNA的表達(dá)也可能是siRNA調(diào)節(jié)ZGA的一種方式。Zhao等[65]在斑馬魚早期胚胎中注射不同的siRNA后，胚胎的大腦和尾巴都會(huì)發(fā)生不同程度的損傷，并且會(huì)導(dǎo)致胚胎中能夠降解母源因子的miR-430的表達(dá)量降低，將siRNA與miR-430共同導(dǎo)入胚胎中則不會(huì)再出現(xiàn)這些缺陷。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是siRNA與miRNA的合成與作用路徑中存在對Dicer酶等共同組分的競爭關(guān)系。Argonaute蛋白家族的AGO1-4的4個(gè)成員都可以參與miRNA形成RISC的過程，缺失任一成員雖然都會(huì)抑制miRNA的活性，卻也可以通過增加其他蛋白來彌補(bǔ)，但是siRNA的作用通路只有AGO2的參與。將小鼠胚胎中的AGO2敲除后胚胎只能發(fā)育到2-細(xì)胞期，本該降解的母源因子也依舊存在，與之對應(yīng)，敲除AGO3和AGO4蛋白后胚胎依然可以成長到囊胚期，這些現(xiàn)象表明siRNA也可能促進(jìn)母源因子的消除[66]。對小鼠不同時(shí)期的胚胎進(jìn)行RNA和小RNA測序，在卵母細(xì)胞和4-細(xì)胞胚胎中差異表達(dá)的母源基因里有1/4都受到endo-siRNA的靶向調(diào)控[67]。Han等[68]對秀麗線蟲的卵母細(xì)胞和胚胎中的小RNA進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)endo-siRNA的長度大多是22 nt和26 nt，其中26 nt的endo-siRNA在胚胎中上調(diào)，而在第四階段的幼蟲期開始下降，在此期間26 nt的endo-siRNA所靶向的母源轉(zhuǎn)錄本驟減，推測這類endo-siRNA可以清除合子發(fā)育過程中的母源因子。之前也有研究表明參與MZT的lncRNA可以在Dicer酶的作用下轉(zhuǎn)化為endosiRNA[69]。

目前明確的siRNA的功能還只是在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟這一層面，即使有很多現(xiàn)象能夠反映endosiRNA可以通過母源降解性通路清除母源mRNA調(diào)節(jié)早期胚胎的ZGA，但由于研究對象和研究方法的單一，當(dāng)前并不能確定siRNA在ZGA中的具體作用效果和機(jī)制。但endo-siRNA在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中廣泛分布的這一特點(diǎn)仍然為探索它在早期胚胎發(fā)育中所扮演的角色提供了很多可能性。

4 piRNA

4.1 piRNA的作用機(jī)制

與miRNA和endo-siRNA不同的是，內(nèi)源性piRNA的形成機(jī)制更加復(fù)雜，它的形成過程中不需要Dicer酶的參與。PiRNA是一類長度為25~35 nt的單鏈非編碼小RNA，因?yàn)樾枰cPIWI亞家族的成員蛋白結(jié)合才能發(fā)揮作用而被命名為PIWI蛋白相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）[70,71]。piRNA最早是在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，目前也被認(rèn)為主要存在于動(dòng)物的生殖細(xì)胞中，所以現(xiàn)階段關(guān)于piRNA的研究內(nèi)容也都圍繞生殖生理方面。編碼piRNA的基因呈現(xiàn)不連續(xù)的簇狀分布所以被稱為piRNA簇，可以單向或雙向轉(zhuǎn)錄生成pre-piRNA[72]。如圖3所示，果蠅生殖細(xì)胞中成熟的piRNA的形成需要經(jīng)過兩種途徑的協(xié)同作用，分別是初級加工途徑和被稱為“乒乓循環(huán)”的次級加工途徑[73]。pre-piRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后與AGO3結(jié)合，經(jīng)Zuc核酸內(nèi)切酶切割后變成piRNA中間體，然后與PIWI蛋白家族中的Aub結(jié)合，被核酸酶剪切成最終的長度后進(jìn)入乒乓循環(huán)；PIWI-piRNA復(fù)合體識(shí)別并切割與piRNA互補(bǔ)的mRNA，使之變成新的piRNA，新piRNA與AGO3蛋白結(jié)合后繼續(xù)切割與之互補(bǔ)的mRNA，如此循環(huán)往復(fù)，piRNA的含量增加，含有與piRNA互補(bǔ)序列的mRNA的含量減少，直到被完全破壞[74]。

圖3 果蠅piRNA的發(fā)生途徑[75]Fig.3 The piRNA pathway in the [75]

4.2 piRNA對母源mRNA清除的影響

目前關(guān)于piRNA的探究普遍集中在雄性配子的發(fā)育與男性不育的治療方面，對它在早期胚胎中的影響尚不清楚，但有一些現(xiàn)象反映piRNA也能參與母源因子的清除。Ohnishi等[76]利用高通量測序分析小鼠減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞和不同階段的植入前胚胎的RNA表達(dá)水平，推測piRNA可能會(huì)沉默一些妨礙早期胚胎重編程的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。Wei等[77]通過下一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)斑馬魚的256-細(xì)胞期胚胎有高水平的piRNA，這種表達(dá)模式可能與母源因子的降解相關(guān)。Kawaoka等[78]分析了家蠶卵母細(xì)胞和胚胎的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)受精卵中的piRNA發(fā)生了激烈的乒乓循環(huán)，推測piRNA可以通過沉默特定轉(zhuǎn)座子的方式調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育。埃及伊蚊胚胎ZGA發(fā)生前無tapiR1的表達(dá)，敲除該piRNA，則早期胚胎發(fā)育停滯，tapiR1的缺失會(huì)造成母源因子上調(diào)并破壞合子基因組轉(zhuǎn)錄[79]。Rouget等[80]發(fā)現(xiàn)果蠅早期胚胎中的piRNA可以與Smaug、CCR4等脫腺苷酸化酶復(fù)合體結(jié)合到母源基因Nanos的3'UTR區(qū)域促使其降解，通過這種方式來參與早期胚胎母源因子的降解。Barckmann等[81]在果蠅早期胚胎中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)可以與Aub蛋白結(jié)合的母源mRNA，在MZT期間這些mRNA都與PIWI-piRNA結(jié)合并被切割和降解；將胚胎中參與降解母源轉(zhuǎn)錄本的CCR4基因突變后piRNA的表達(dá)量隨之上升，推測piRNA也可以通過降解母源因子來彌補(bǔ)CCR4缺失的不足。

5 展望

高通量測序和基因敲除技術(shù)的廣泛應(yīng)用逐漸揭開了sncRNAs的神秘面紗。不斷有研究發(fā)現(xiàn)sncRNAs可以參與早期胚胎MZT過程中的母源因子清除，激發(fā)合子基因組的表達(dá)，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。從sncRNAs水平上研究早期胚胎MZT的機(jī)制，將有助于獲得早期胚胎發(fā)育機(jī)制的重要分子標(biāo)記，為增加哺乳動(dòng)物的繁殖潛力和提高后代存活率提供理論依據(jù)。