潘文，馬良，張賀楠，邵葳，李曉冉，黃書林

(1.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070； 2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點實驗室，北京100095)

豬偽狂犬病病毒ZY-2014株的分離與鑒定

潘文1，2，馬良1，2，張賀楠1，2，邵葳1，2，李曉冉1，2，黃書林1,2*

(1.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070； 2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點實驗室，北京100095)

從河南省某規(guī)模化豬場的死亡仔豬中分離到1株疑似豬偽狂犬病病毒，命名為ZY-2014株，并對其進(jìn)行了PCR鑒定、gE基因序列分析、動物感染試驗等鑒定。病毒經(jīng)vero細(xì)胞培養(yǎng)可產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，用Reed-Muench法測定病毒的滴度為107.4TCID50/100 μL。分離病毒基因組DNA經(jīng)過gD、gE、gG、三對特異性檢測引物擴(kuò)增后，均出現(xiàn)偽狂犬病毒特異性目的條帶，分別為217 bp、636 bp、1440 bp。測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。將ZY-2014毒株gE基因測序結(jié)果與10個新分離毒株、14個經(jīng)典毒株進(jìn)行同源性比對分析，其核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)2012年以來新分離毒株的同源性分別為99.6%～100%和99.1%～100%，與2012年以前分離毒株核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為97.7%～99.6% 和95.7%～99.3%。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，所分離的ZY-2014毒株與2012年以來新分離毒株同屬一分支，與經(jīng)典毒株分屬不同進(jìn)化分支。動物攻毒試驗中，家兔和小鼠均出現(xiàn)明顯的偽狂犬病臨床癥狀。鑒定試驗表明，分離株ZY-2014是一株豬偽狂犬變異毒株。

豬偽狂犬病毒；分離；鑒定

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，國際動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類傳染病[1]。豬是偽狂犬病的最主要宿主，豬感染PRV后的臨床癥狀隨著年齡不同差異很大。新生仔豬及15日齡以內(nèi)的仔豬表現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率達(dá)100 %。育肥豬常呈隱形感染，成年豬感染后多耐過，但長期排毒，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等[2]。在規(guī)模化豬場，一般采用PRV基因缺失疫苗對豬偽狂犬病進(jìn)行免疫預(yù)防[3]。雖然偶爾有病毒分離的報道，但總體而言該病得到了有效的控制[4]。2011年豬偽狂犬病疫情率先在華北暴發(fā)以來，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了疑似偽狂犬病流行[5]，各科研單位從不同地區(qū)發(fā)病死亡的仔豬組織中分離到多株偽狂犬病毒變異株[6-8]。2014年河南省某規(guī)?；i場在已免疫過PRV gE基因缺失疫苗(Bartha-K61株)的情況下，仔豬出現(xiàn)疑似PR典型癥狀并死亡，本實驗室從死亡仔豬的腦組織、肺臟、腎臟中分離到1株疑似豬偽狂犬病病毒，命名為ZY-2014株，并對其進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛清血、2×MEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。病毒基因組DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒為瓊脂糖為Omega公司產(chǎn)品。DH5α感受態(tài)細(xì)胞為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；T載體、DNA marker DL2000、TaKaRa LA Taq?with GC buffer為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板Corning為康寧公司產(chǎn)品；低熔點瓊脂為PROMEGA公司產(chǎn)品；中性紅為sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 病料及血清 病料來自于2頭出現(xiàn)豬偽狂犬典型癥狀死亡仔豬的腦組織、肺臟、腎臟。

1.1.3實驗動物 SPF級BALB/C小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；普通級大耳白兔購自北京芳元緣養(yǎng)殖場。

1.2 方法1.2.1 病料處理 取病料進(jìn)行研磨，用DMEM 培養(yǎng)液制成 1∶5 乳劑，反復(fù)凍融三次，3000 r/min離心30 min后，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，加入青霉素溶液至最終濃度為300 IU/mL、鏈霉素為100 μg/mL。

1.2.2 病毒分離及鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞接種試驗 接種0.5 mL病毒濾液于長成單層的Vero細(xì)胞，連續(xù)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，接種后36～72h，細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，拉網(wǎng)、脫落。如第一次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代。

1.2.2.2 PRV蝕斑克隆純化用DMEM 將PRV病毒液做10倍系列稀釋，將10-6、10-5、10-4、10-3稀釋病毒液接種于長滿Vero 細(xì)胞單層的6孔板中，每孔接0.5 mL，同時設(shè)一未添加該病毒的陰性對照孔。37 ℃吸附1.5 h后吸去病毒液，等比例加入57 ℃預(yù)溫的2%瓊脂糖和37 ℃預(yù)溫的2×MEM 養(yǎng)液2.0 mL，在37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。48 h后添加1.0 mL含有0.01%中性紅染液的營養(yǎng)瓊脂，第二層瓊脂加入后觀察蝕斑的大小、形態(tài)和出現(xiàn)時間。將挑取的蝕斑放入500 μL DMEM的離心管中，經(jīng)凍融后以3000 r/min離心10 min，取上清按上述方法重復(fù)克隆2次后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，測定克隆毒株的病毒含量。1.2.2.3 病毒滴度的測定 將純化收集的病毒原液用細(xì)胞維持液進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋(10-3～10-9)后，按100 μL/孔接種長滿單層vero細(xì)胞的96孔板，每個稀釋度做8孔，加入等量的維持液作為陰性對照，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種12 h后開始觀察記錄CPE，觀察96 h后統(tǒng)計CPE結(jié)果，用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.2.3 病毒的PCR檢測及gE基因序列分析

1.2.3.1 引物設(shè)計 參考“國標(biāo)GB/T 18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù)”擴(kuò)增偽狂犬病毒gD基因中434～651 bp之間217 bp基因片段，序列為：上游引物P1:5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引物P2:5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’。設(shè)計合成針對豬偽狂犬病病毒gE基因特異性引物，上游引物P3:5’-ATGAATTCGAGGCCGACGAC-GATGACC-3’，下游引物P4:5’- TAAAGCTTCGTGGCGGTAAAGTTCTCA -3’，目的片段大小為636 bp。設(shè)計合成針對豬偽狂犬病病毒gG基因特異性引物上游引物P5:5’- ATGAATTCAGAGAGGCCCCTC-GGGA -3’，下游引物P6:5’- TAAAGCTTTCAGGCG-GAGGCCACGT-3’，目的片段大小為1440 bp。同時設(shè)計擴(kuò)增PRV gE全基因的特異性引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.3.2 目的基因的擴(kuò)增與克隆 取200 μL病毒液，按照病毒基因組提取試劑盒說明書提取PRV基因組。用所設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，其中2×GC buffer 2.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2 μL，上下游引物(10 pmol/mL)各1 μL，DNA模板4 μL， LATaq酶0.5 μL，補充無菌去離子水至終體積50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)后；72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL，置于濃度為10 g/L 瓊脂糖凝膠上電泳。

1.2.3.3 gE基因序列分析 將擴(kuò)增的PRV gE全長 PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，陽性重組質(zhì)粒送由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。利用基因分析軟件DNA Star中的MegAlign對ZY-2014毒株gE測序結(jié)果與GenBank中登陸的10個新分離毒株、14個經(jīng)典毒株進(jìn)行同源性比對分析，并使用 Mega 4.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.2.4 動物感染試驗

1.2.4.1 病毒感染小鼠試驗 取10只BALB/C小鼠，分為三組。第1組和第2組各4只小鼠，分別在其背部皮下多點接種100 μL 106.0TCID50/mL、105.0TCID50/mL兩個不同濃度的病毒稀釋液，第三組接種細(xì)胞培養(yǎng)液作為對照，隔離觀察。

1.2.4.2 病毒感染家兔試驗 取4只健康且體況相似的成年雄兔，分為2組，分別在其后肢大腿肌肉接種0.4 mL 108.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL兩個不同濃度病毒稀釋液，每個濃度各兩只。觀察其發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離鑒定 病料組織接種vero細(xì)胞后，24 h出現(xiàn)明顯的CPE，可見細(xì)胞圓縮，出現(xiàn)空泡，隨后細(xì)胞聚集成合胞體，48 h后細(xì)胞開始溶解，出現(xiàn)大面積脫落(圖1)。2.2 PRV蝕斑克隆純化 將分離到的ZY-2014毒株進(jìn)行蝕斑純化，蝕斑形態(tài)較為均一，大小為(0.5±0.01)mm，蝕斑形態(tài)見圖2，蝕斑中心為不著色的死亡細(xì)胞，周圍正常細(xì)胞被中性紅染成紅色。病毒經(jīng)過兩次蝕斑純化，病毒滴度為107.4TCID50/100 μL。

2.3 病毒的PCR檢測 將分離到的ZY-2014毒株基因組DNA經(jīng)過gD、gE、gG三對特異性檢測引物擴(kuò)增后，均出現(xiàn)gD、gE、gG部分基因的特異性目的條帶，條帶大小(圖3)與測序結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 gE基因序列分析 重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明ZY-2014毒株gE基因完整的閱讀框全長1740 bp，編碼579個氨基酸。ZY-2014毒株gE基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)2012年以來新分離毒株的同源性分別為99.6%～100%和99.1%～100%。與2012年以前分離毒株核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為97.7%～99.6% 和95.7%～99.3%。其中ZY-2014毒株gE基因核苷酸的同源性與JS-2012株、HNXX-2012株、ZM-2012株為100%，與GDSH-1999株、Ea-1998株的核苷酸同源性分別為99.6%和99.5%，與韓國Yangsan-2003株、馬來西亞P-PrV-2008的同源性分別為99.5%和99.4%，而與美國Becker株、匈牙利Kaplan 株、愛爾蘭 Nia-1株、西班牙NiA-3株的同源性較低為97.7%～97.9%。

通過對gE基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹( 圖4) ，結(jié)果表明遺傳進(jìn)化樹出現(xiàn)兩個較大的分支，分別為亞洲毒株和歐美毒株。其中所分離的ZY-2014毒株與2012年以來新分離毒株同屬一個大分支，與2012年前經(jīng)典毒株EA株、GDSH株、FA株、MinA株、LA株等分屬不同進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，與經(jīng)典毒株Becker株、Kaplan 株、Nia-1株、NiA-3的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

A: 豬偽狂犬病毒gD片段(217bp)；1～2:病毒F1、F2代vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取的基因組；3:豬偽狂犬病毒HB98株提取的基因組；4:陰性對照 B: 豬偽狂犬病毒gE片段(636bp)；1～2:病毒F1、F2代vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取的基因組；3:陽性對照質(zhì)粒pET32a-E；4:陰性對照 C: 豬偽狂犬病毒gG片段(1440bp)；1～2:病毒F1、F2代vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取的基因組；3:陽性對照質(zhì)粒pET32a-G；4:陰性對照圖3 PRV ZY-2014毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果

2.5 小鼠感染試驗結(jié)果BALB/C小鼠攻毒48 h后，陸續(xù)出現(xiàn)偽狂犬典型的癥狀，全身奇癢，不斷啃咬接種部位導(dǎo)致皮膚出血，攻毒小鼠96 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，5 d后第1組小鼠全部死亡，第2組存活1只小鼠。對照組小鼠無異常表現(xiàn)，見圖5。

圖4 不同PRV毒株gE基因的遺傳進(jìn)化樹

A.正常小鼠；B.攻毒小鼠啃咬注射部位；C.攻毒小鼠死亡圖5 PRV ZY-2014毒株小鼠感染試驗

2.6 家兔感染試驗結(jié)果家兔接毒后24～36 h，表現(xiàn)精神亢奮，食欲減退，啃咬接種部位，接毒40 h后高劑量組的兩只家兔出現(xiàn)典型角弓反張肌肉顫抖等神經(jīng)癥狀后相繼死亡。低劑量組的兩只家兔啃咬接種部位至皮膚出血，60 h后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后相繼出現(xiàn)死亡，見圖6。

A.正常家兔；B.接毒后家兔啃咬注射部位；C. 107.4 TCID50攻毒劑量家兔死亡；D.105.4 TCID50攻毒劑量家兔死亡圖6 PRV ZY-2014毒株家兔感染試驗

3 討論與小結(jié)

2011年以來，各科研單位從我國相繼暴發(fā)豬偽狂犬病的豬場中分離到多株偽狂犬病毒，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所童光志研究員團(tuán)隊分離到了HeN1株[6]、JS-2012株[9]，哈爾濱獸醫(yī)研究所仇化吉研究員團(tuán)隊分離的TJ株[7]，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授的團(tuán)隊分離的ZJ01株[8]等。序列分析表明偽狂犬新分離毒株存在變異，變異株致病性較之前的偽狂犬病毒有所增強(qiáng)，而且由于抗原性發(fā)生變異，現(xiàn)有的gE基因缺失疫苗不能針對新的流行毒提供完全的臨床保護(hù)。流行毒株gE基因序列與以往發(fā)表的相關(guān)序列比對顯示，這些分離株均屬于一個相對獨立的分支[10]。

本研究從已免疫過PRV gE基因缺失疫苗(Bartha-K61株)的死亡仔豬中分離到1株豬偽狂犬病病毒，經(jīng)蝕斑純化，PCR鑒定、動物感染試驗等方法鑒定為豬偽狂犬病毒，命名為ZY-2014株。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明ZY-2014毒株gE基因完整的閱讀框全長1740 bp，編碼579個氨基酸。ZY-2014毒株gE基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)2012年以來新分離毒株的同源性分別為99.6%～100%和99.1%～100%，與2012年以前分離毒株核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為97.7%～99.6% 和95.7%～99.3%。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明所分離的ZY-2014毒株與2012年以來新分離毒株，如HeN1株、JS-2012株、 ZJ01株同屬一個大分支，與2012年前經(jīng)典毒株EA株、GDSH株、FA株、MinA株、LA株等分屬不同進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，與經(jīng)典毒株Becker株、Kaplan 株、Nia-1株、NiA-3的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外趙鴻遠(yuǎn)[10]、張青占[11]、陳秋勇[12]等報道新分離毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492～496位各有1個天冬氨酸的插入，而2012年前分離到的毒株只有個別位置插入一個氨基酸，絕大部分沒有插入。ZY-2014株在48aa處492aa處各插入一個天冬氨酸，與報道相符，進(jìn)一步證ZY-2014株屬于新流行毒株。

本研究分離到的ZY-2014株與國內(nèi)2012年以來流行的變異株具有很高的同源性，為新的偽狂犬變異毒株，這將為偽狂犬病防控提供流行病學(xué)依據(jù)并為偽狂犬新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

[1] 人與動物共患病[M].田克恭.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2013:81-85.

[2] Jeffrey JZ, Locke A K, Alejandro R.豬病學(xué)[M].趙德明,張仲秋,周向梅，等,譯.第十版.北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2014:438-445.[3] 呂素芳,郭廣君,魏鳳,等.豬偽狂犬病病毒gE-/gI-/TK-/多基因缺失活疫苗對豬的安全性與免疫效力研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(4):1-5.

[4] 彭金美,安同慶,童光志,等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報2013,35(1):1-4.

[5] 胡睿銘, 湯細(xì)彪, 劉峰,等.2011-2013豬偽狂犬病在我國部分地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查與分析[C]. 第十四屆全國規(guī)?；i場主要疫病監(jiān)控與凈化專題研討會論文集,2014:83-88.

[6] Ye C, Zhang Q Z, Tong G Z,etal.Genomic characterization of emergent pseudorabies virus in Chinareveals marked sequence divergence: evidence for the existenceof two major genotypes[J]. Virology,2015,483:32-43.

[7] Wang C H, Yuan J, Qin H Y,etal. A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in china[J].Vaccine, 2014,32(27):3379-3385.

[8] Gu Z, Hou C, Jiang P,etal.Emergence of highly virulent pseudorabies virus in southern China[J].Can J Vet Res,2015,79(3):221-228.

[9] 童武, 鄭浩, 童光志,等.偽狂犬病毒變異株(JS-2012)對仔豬的致病性研究[J]. 中國動物傳染病學(xué)2014,22(5): 10-14.

[10]趙鴻遠(yuǎn), 彭金美, 安同慶,等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2014,36(7) :506-509.

[11]張青占. 變異豬偽狂犬病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性分析[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013.

[12]陳秋勇, 吳學(xué)敏, 修金生,等. 豬偽狂犬病病毒FZ-2012株的分離鑒定及其gE基因的遺傳演化分析[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2015,47(7) :17-20.

(編輯：李文平)

Isolation and Identification of Variant Strain ZY-2014 of Pseudorabies Virus

PAN Wen1，2, MA Liang1，2, ZHANG He-nan1，2, SHAO Wei1，2, LI Xiao-ran1，2, HUANG Shu-lin1，2*

(1.ChinaAnimalHusbandryIndustryCo.Ltd,Beijing100070,China; 2.KeyLaboratoryofBiologicalProductsandChemicalDrugsforAnimals,MinistryofAgriculture,Beijing100095,China)

A suspected pseudorabies virus variant, named ZY-2014, was isolated from dead piglets in a large-scale pig farms of Henan province and determined by PCR identification,gE gene sequence analysis and animal infection tests. The virus grown on vero cell culture can produced typical cytopathic effect. The virus titer was 107.4TCID50/100 μL confirmed by the Reed-Muench methods.Three specific pseudorabies virus target bands of 217 bp, 636 bp, 1440 bp were detected using gD, gE, gG specific PCR respectively. Sequencing results were consistent with the expected results.The homologies of gE nucleotide and amino acid sequence were analyzed with other reference strains, including 10 viral strain that had been isolated since 2012 and 14 classical strains. The gE gene of ZY-2014 strain shared 99.6% to 100% nucleotide homology and 99.1% to 100% amino acid homology with newly isolated PRV strains respectively, and shared 97.7% to 99.6% homologies in nucleotide sequence and 95.7% to 99.3% in amino acid sequence with classical PRV strain respectively. Based on the phylogenetic analysis, ZY-2014 strain was clustered to a relatively independent branch together with newly isolated strain in recent three year, and far from the classical strains. The typical pseudorabies clinical symptoms were presented in rabbits and mice inoculated with ZY-2014 strain.These results demonstrated that a new wild pseudorabies virus had been isolated.

pseudorabies virus；isolation；identification

潘文，碩士，中級獸醫(yī)師，從事動物疫苗研發(fā)工作。

黃書林。E-mail：Hslcau@163.com

2016-01-19

A

1002-1280 (2016) 05-0001-06

S852.65