宋明銘，王佳奇，李瑩，劉一桐，趙婷，劉文叢*

(1吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；2吉林省凱洛士科技有限公司，長春 130000)

響應曲面法優(yōu)化精氨酸單糖苷合成工藝

宋明銘1，王佳奇1，李瑩1，劉一桐1，趙婷2，劉文叢1*

(1吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；2吉林省凱洛士科技有限公司，長春 130000)

利用響應曲面法對蘋果酸催化合成精氨酸單糖苷(AF)條件進行優(yōu)化。本文在單因素的基礎上，以精氨酸單糖苷的合成率為考察指標，建立以反應時間、反應溫度、料液比和蘋果酸加入量的4因素3水平的實驗模型，采用 Design Expert 8.0.6 分析軟件對精氨酸單糖苷的合成條件進行優(yōu)化研究。結果表明，合成AF的最佳工藝條件，反應溫度為85℃，反應時間150 min ,料液比1∶20 g/mL,蘋果酸加入量為0.75 g。優(yōu)化出來的最佳合成條件穩(wěn)定可行、合成率高。

精氨酸單糖苷；蘋果酸；響應面分析法

精氨酸單糖苷英文名為Arginyl-Fructose，簡稱AF，又稱為精氨酸果糖苷，存在于自然界的許多動植物中，鄭毅男[1-2]在鮮參加工成生曬參、紅參的過程中，發(fā)現(xiàn)AF的存在。為美拉德反應的非褐變部分，是精氨酸與葡萄糖羥醛脫水縮合的產(chǎn)物[3-5]。分子量為337.3，化學名稱為1-(精氨酸-Nα基)-1-去氧-D果糖，其結構如圖1所示。純化后的AF單體為白色粉末，AF極易溶于水，幾乎不溶于有機溶劑，如甲醇等，具有吸濕性，對熱不穩(wěn)定。研究表明，AF具有抗氧化[6-8]、抗腫瘤[9]、促進微循環(huán)[10]等功能，而且具有抑制葡萄糖苷酶、抗糖尿病[11-12]等作用。

圖1 AF化學結構

AF單體在自然界中含量較低，不易分離純化且成本較高，因此人工合成的方法成為獲取大量AF的主要途徑。目前，合成AF的主要方法是以精氨酸和葡萄糖為底物，冰醋酸為催化劑，但此方法合成率低，且冰醋酸強烈的刺激氣味限制了生產(chǎn)應用。本研究以可食用的蘋果酸為催化劑，丙三醇為溶酶體，優(yōu)化AF合成條件，以促進其開發(fā)應用。

響應曲面法(Response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化生物過程的統(tǒng)計學試驗，采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間函數(shù)關系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法[13-21]。本文在單因素的基礎上，以反應時間、反應溫度、料液比和蘋果酸加入量為關鍵因子，利用相應曲面法對AF合成條件進行優(yōu)化，確定其最佳合成工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 L-精氨酸(奧博星生物技術有限公司)；葡萄糖、丙三醇、冰乙酸、磷酸(北京化工廠)；蘋果酸(廣州利源食品添加劑有限公司)；乙酸鈉(西隴化工股份有限公司)；乙腈(美國，OMNI CHEM,色譜級)；水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 儀器與設備 電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；水浴恒溫振蕩器(上海龍躍儀器設備有限公司)；冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；LC-2010A高效液相色譜儀(LC solution工作站、SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT 泵， CTO-10AS VP 柱溫箱，日本島津公司)

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取AF對照品5 mg，用水定容于10 mL 容量瓶中，分別移取2、4、6、8 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得質量濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的對照品溶液。

HPLC條件：Venusil-AA 氨基酸分析專用柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：A相-乙酸鈉緩沖溶液(925 mL純凈水，7.6 g乙酸鈉，2 mL磷酸，2～3 d冰乙酸，75 mL乙腈)，B相-有機相(乙腈∶水= 4∶1)。流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫40℃；進樣量20 μL。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 篩選最佳反應時間 固定反應溫度85℃，料液比1∶20，蘋果酸加入量0.75 g,考察反應時間為60、90、120、150、180 min對AF合成率的影響。

1.3.2.2 篩選最佳反應溫度 固定反應時間150 min,料液比1∶20，蘋果酸加入量0.75 g,考察反應溫度為70、75、80、85、90℃對AF合成率的影響。

1.3.2.3 篩選最佳料液比 固定反應時間150 min，反應溫度85 ℃,蘋果酸加入量0.75 g,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL對AF合成率的影響。1.3.2.4 篩選最佳蘋果酸加入量 固定反應時間150 min，反應溫度85℃,料液比1∶20，考察蘋果酸加入量0.5、0.75、1.0、1.25 g對AF合成率的影響。

1.3.3 響應面法試驗 在單因素的基礎上，采用統(tǒng)計分析軟件DesignExpert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，以反應時間(X1)、反應溫度(X2)、料液比(X3)、蘋果酸加入量(X4)為自變量，AF合成率(Y)為響應值，進行優(yōu)化，試驗因素與水平編碼如表1所示。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制 測定不同濃度的AF對照品溶液在254 nm下的峰面積，以質量濃度X(mg/mL)對峰面積Y繪制標準曲線，得到回歸方程為：Y=301959X+1052.8，R2=0.9993，在質量濃度 0.1～0.5 mg/mL內(nèi)呈良好線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 反應時間對AF合成率的影響 在其它試驗條件不變的情況下，隨著時間的延長，蘋果酸催化的AF 合成率逐漸升高，當時間達到150 min時，合成率達到最高點，隨著反應繼續(xù)，反應向AF減少方向進行(圖2)。因此，Box-Behnken試驗選取的反應時間的范圍為120～180 min。

圖2 反應時間對AF合成率的影響

2.2.2 反應溫度對AF合成率的影響 多次試驗發(fā)現(xiàn)，溫度70-90℃之間時，AF的合成反應迅速發(fā)生，符合AF在紅參中形成的溫度條件，當溫度達到85℃時，AF合成率達到最高點，隨著溫度繼續(xù)升高，合成率降低(圖3)。因此，Box-Behnken試驗選取的反應溫度的范圍為80-90℃。

圖3 反應溫度對AF合成率的影響

2.2.3 料液比對AF合成率的影響 在其它試驗條件不變的情況下，以料液比為變量時，丙三醇加量過低時，反應不易混勻，且反應不徹底，合成率偏低，隨著溶媒體積的增大，達到1∶20 g/mL時，AF合成率最高，隨著丙三醇體積繼續(xù)增加，合成率下降(圖4)。因此，Box-Behnken試驗選取的料液比的范圍為1∶15～1∶25 g/mL。

圖4 料液比對AF合成率的影響

2.2.4 蘋果酸加入量對AF合成率的影響 在其它試驗條件不變的情況下，隨著蘋果酸加入量的增加，AF的合成率逐漸升高，蘋果酸加入量達到0.75 g時，合成率達到最大值，隨后隨著蘋果酸含量的增加而有所降低(圖5)。因此，Box-Behnken試驗選取的蘋果酸加入量的范圍為0.5～1.0 g。

圖5 蘋果酸加入量對AF合成率的影響

2.3 響應面法優(yōu)化合成試驗結果與分析

2.3.1 結果分析 運用Design Expert 8.0.6分析軟件進行Box-Behnken設計，設計方案及其試驗結果見表2，試驗號1～24位析因實驗，試驗號25～29位中心試驗。

對表2的試驗結果進行分析，得到AF合成率(Y)對反應溫度(X1)、反應時間(X2)、料液比(X3)、加酸量(X4)的二次多項回歸方程為：

表3為回歸模型的方差分析結果，該模型F值為53.18、R2=0.9815、P<0.0001，說明回歸方程的你和程度較好，試驗具有很高的可信性和準確性。模型的修正相關系數(shù)R2Adj=0.9631，表明該方程較好地反映了合成時間、合成溫度、料液比和蘋果酸加入量與AF合成率的關系，說明該模型能夠解釋96.31%的響應值變化，因此可用此模型對AF的合成進行分析和預測。從F值的分析結果(A=95.2、B=32.83、C=34.03、D=11.89)可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對AF 合成率的影響大小的順序為：反應溫度>料液比>反應時間>蘋果酸加入量。

表2 Box-Behnken試驗設計方案與結果

表3 回歸模型方差分析結果

R2=0.9815，R2Adj=0.9631，R2Pred=0.9159，CV=1.81

2.3.2 AF合成工藝的響應面分析與優(yōu)化 圖6為各因素交互作用對AF合成率影響的響應曲面圖。A圖為等高線， B圖為相對應的響應曲面圖。

圖6d、6f曲面陡峭，等高線呈橢圓形，說明反應溫度與料液比、料液比與蘋果酸加入量有很強的交互作用，呈極顯著性；圖6a、6e曲面相對平緩，說明反應溫度與反應時間、反應溫度與料液比、反應時間與料液比有一定的交互作用，但等高線幾乎為圓形，交互作用不是很強；圖6c曲面平緩，等高線為圓形，說明反應溫度與蘋果酸加入量交互作用不顯著。圖6中均存在極值，說明試驗所選范圍比較合理。

2.3.3 AF合成工藝條件的確定 結合回歸模型分析結果可知，AF合成的最佳工藝條件為反應溫度85℃、反應時間150 min、液料比1∶20(g/mL)、蘋果酸加入量0.75 g。在此條件下AF的理論合成率為67.79%，實際合成率為68.92%,理論值與實際值基本吻合。由此可見，響應面分析法所優(yōu)化的最佳合成工藝數(shù)據(jù)真實可靠。

圖6 各因素交互作用對AF合成率影響的等高線圖和響應曲面圖

3 討論與小結

采用響應曲面法優(yōu)化AF合成工藝，通過合理的實驗設計，從而得出各因素對AF合成率影響大小依次為：反應溫度>料液比>反應時間>蘋果酸加入量。料液比和蘋果酸加入量對AF合成的交互影響最為顯著。其最佳合成條件為反應溫度85℃、反應時間150 min、料液比1∶20(g/mL)、蘋果酸加入量0.75 g，AF的實際合成率為68.92%。實驗采用的響應曲面模型顯著性較好，結果準確可靠，該研究結果是對人工合成AF方法的進一步完善，具有一定的理論參考價值和實際應用前景。

AF單體在自然界中含量低，分離純化難，因此采用人工合成的方法，以降低AF合成成本，提高利用價值。趙婷[11]、鄭毅男等[5]以冰醋酸為催化劑合成AF,合成率為20～30%左右。冰醋酸是一種有機一元酸，具有腐蝕性，且有強烈的刺激性氣味，其蒸汽對眼和鼻有刺激性作用，且合成率低。所以需要選取一種在自然狀態(tài)或加熱后呈酸性、無腐蝕性、無副作用的催化劑。鑒于以上特點，本文選取蘋果酸[22]為催化劑，它是常用的食品酸味劑，幾乎存在于一切果實中，且味道柔和，從未發(fā)現(xiàn)不良反應，是合成食藥通用的AF較好的選擇之一。AF的生成是在加熱和無水條件下，所以反應媒介必須滿足熔點低、沸點高的條件，無刺激性氣味、無毒副作用、與反應底物不發(fā)生反應，且可作為食品等材料使用。綜合考慮及試驗篩選，選取丙三醇沒反應媒介。

本文利用響應面法優(yōu)化AF合成工藝，克服了傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計數(shù)據(jù)量大的缺點，且彌補了正交試驗無法找到因素的最佳組合以及響應值的最優(yōu)值的弊端，響應面法更好地處理離散水平值，實驗周期短、精密度高，能對因素間交互作用進行研究，篩選出最佳合成條件，顯著提高了AF合成率，為下一步研究奠定基礎，也使得AF大量生產(chǎn)使用成為可能。

[1] 鄭毅男,松浦幸永,韓立坤,等.紅參中新化合物-精氨酸衍生物的分離與結構鑒定[J]. 藥學學報, 1996,31(3):191-195.

[2] Zheng Y N, Okuda H, Han L K,etal. A new amino acid derivative from red ginseng [J]. Acta Pharmaceutica Sinica( B), 1998, 7:7-10.

[3] Takaku T, Han, L K, Kameda K,etal. Production of arginyl-frictosyl glucose during processing of red ginseng[J]. J. Tradit. Med, 1996, 13, 118-123.

[4] Gao F F. Zhang W Y, Liu L M,etal.Detection and distribution of arginine derivatives in Panax quin- quefolius L.and investigations of their antioxidant properties[J]. Lebenson Wiss Technol, 2012, 49:34-41.[5] 鄭毅男.楊世杰.精氨酸糖苷的制備方法 [P]. CN, ZL201110038843. 7. 2012-07-04.

[6] Suzuki Y, Choi, K J, Uchida K,etal. Arginyl-fructosyl-glucose and arginyl-fructose, compounds related to browning reaction in the model system of steaming and heat-drying processes for the preparation of red ginseng[J]. Ginseng Res, 2004, 28, 143-148.

[7] Cho E, Piao X L, Jang M H,etal. The effect of steaming on the free amino acid contents and antioxidant activity of Panax ginseng. J. Food Chem. 2008, 107: 876-882.

[8] Lee J S, Kim G N, Lee S H,etal.Invitroand cellular antioxidant activity of arginyl-fructose and arginyl-fructosyl-glucose [J]. Food Science and Biotechnology, 2009, 18(6), 1505-1510.

[9] Keum Y S, Park K K, Lee J M,etal. Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng [J]. Cancer Lett, 2000,150,41-48.

[10]鄭毅男,張晶,奧田拓道,等.精氨酸衍生物對微循環(huán)的作用[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,1998,20(4):45-47.

[11]趙婷.人工合成L-精氨酸單糖苷(AF)及其抗糖尿病藥理活性研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學,2013,16-22.

[12]Lee K H, Ha K S, Jo S H,etal. Effect of Long-Term Dietary Arginyl-Fructose (AF) on Hyperglycemia and HbA1c in Diabetic db/db Mice[J]. Mol. Sci. 2014, 15, 8352-8359.

[13]趙立春,楊更亮. 響應曲面法在中藥有效成分提取中的應用研究[J]. 中藥與臨床,2013, 4(6):62-64.

[14]于淼,柏云嬌,代岐昌,等. 響應曲面法優(yōu)化文殊蘭中生物堿的提取工藝[J].中草藥,2013,44(10):1286-1289.

[15]王金璽,包振偉,劉笑,等.響應曲面法優(yōu)化平菇多糖提取工藝[J].中國釀造,2013,23(40):108-112.

[16]柴婧,付警輝,張衛(wèi)鵬,等.響應曲面法優(yōu)化酶輔助閃式提取二氫槲皮素工藝[J].食品科學,2014,35(10):93-97.

[17]吳燕,盛尊來,高凌飛,等.響應面法優(yōu)化丁香葉總酚酸提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2015,36(2):286-290.

[18]錢丹丹,李新華,楊強,等.響應面分析法優(yōu)化水飛薊多糖提取工藝[J].食品工業(yè),2015,36(6):117-120.

[19]朱盛林,鄭玲利,袁明勇,等.響應面法優(yōu)化附子多糖的微博提取工藝[J].中國醫(yī)藥導報,2015,12(16):48-51.

[20]王健,曾吉祥,龔遠林.響應曲面法優(yōu)化姜黃素包合物的制備[J].川北醫(yī)學院學報,2015,30(2):166-169.

[21]吳軍林,吳清平,張菊梅,等.L-蘋果酸生物合成研究進展[J] .食品科學,2014,35(2):238-242.

(編輯：陳希)

Optimization of Arginyl-Fructose Synthesis Process by Response Surface Methodology

SONG Ming-ming1, WANG Jia-qi1, LI Ying1, LIU Yi-tong1, ZHAO Ting2, LIU Wen-cong1*

(1JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China；2JinLinKaiLuo-shiBio-tech,Changchun130000,China)

The synthesis conditions of Arginy-Fructose(AF) were optimized by response surface methodology ,and malic acid as catalyst.On the basis of single factor,the experimental models of 4 factors and 3 levels was used in this test with AF synthetic ratio as selection standard.Optimizing the synthesis condition of AF was simulated by Design Expert 8.0.6. The best synthesis condition of AF was received with 0.75 g malic acid, 85℃, 150 min and 1∶20 g/mL solvent ratio.This preparation process of AF has the advantages of high synthesis rate and established.

Arginyl-Fructose; malic acid; response surface methodology

延邊州科技發(fā)展計劃項目(2015JH01)

宋明銘,碩士研究生,從事中藥新藥研究與開發(fā)。

劉文叢。E-mail:jwlw6803@126.com

2016-03-31

A

1002-1280 (2016) 05-0045-07

R931.6