吳家鑫，劉敏，尚飛，齊鵬，張國棟，梁景樂

(1.中牧實業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)研究中心，北京 100095；2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院，北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029；3.北京化工大學分析測試中心，北京 100029；4.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070)

利用超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜鑒別預(yù)混劑中黃霉素

吳家鑫1，劉敏2，尚飛3，齊鵬1，張國棟1，梁景樂4

(1.中牧實業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)研究中心，北京 100095；2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院，北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029；3.北京化工大學分析測試中心，北京 100029；4.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070)

利用超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜對預(yù)混劑中的黃霉素5種組分進行鑒別分析。采用C18色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸銨)為流動相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，檢測方式為負離子全掃描模式，通過保留時間、精確分子量和二級質(zhì)譜特征碎片完成對黃霉素的5種組分的鑒別。與高效液相色譜方法比較，本方法具有判斷準確、檢測快速的特點，具有很好的應(yīng)用價值。

鑒別；黃霉素；超高效液相色譜；高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜

黃霉素(flavomycin)，又名斑伯霉素(banbermycin)、默諾霉素(moenomycin)，屬于磷酸多糖類抗生素[1]，含有A、A12、C1、C3、C4五種活性成分(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)[2-4]，其中A組分含量超過50%，5個成分抗菌活性類似[5-7]。黃霉素主要對革蘭氏陽性菌具有抑制作用，其作用機理是干擾細胞壁構(gòu)成物質(zhì)肽聚糖的生物合成[8-10]。黃霉素可以有效提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率，通常作為一種動物生長促進劑使用[11-13]。

圖1 黃霉素5種成分結(jié)構(gòu)式

目前國內(nèi)多使用高效液相色譜法對預(yù)混劑中黃霉素的不同組分進行鑒別研究[1]，也有文獻報道使用離子對試劑分析鑒別黃霉素[14]。雖然上述方法可以簡單快速的鑒別黃霉素的不同成分，但是這些方法僅僅依靠不同組分極性的差異來進行區(qū)分，證據(jù)較為匱乏。超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜法在定性鑒別檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。本文通過超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜分析鑒別預(yù)混劑中黃霉素的不同組分，對黃霉素不同組分的精確分子量與特征碎片進行定性分析，從而建立了一種更有效的定性鑒別黃霉素不同組分的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Agilent 7890B超高效液相色譜儀，配備二元梯度泵，真空在線脫氣機，自動進樣器，Agilent 6540Q-TOF質(zhì)譜儀；儀器控制、數(shù)據(jù)采集軟件及數(shù)據(jù)分析軟件采用Agilent公司的Mass Hunter系統(tǒng)。

黃霉素標準品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(1395黃霉素單位/mg)；黃霉素預(yù)混劑(含量4%)，中牧實業(yè)股份有限公司；甲酸，F(xiàn)isher公司，色譜純；乙腈，F(xiàn)isher公司，質(zhì)譜純。

1.2 方法

1.2.1 超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測方法 超高效液相色譜條件：Agilent Extend-C18色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸銨)，B相為乙腈；流速0.4 mL/min。進樣體積為3 μL；梯度洗脫程序：0.00→7.00 min，90%→10%A；7.00→7.10 min，10%→90%A；7.10→10.00 min，90%→90%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧負離子源(ESI-)，電壓3500 V， 干燥氣溫度 300 ℃, 錐孔電壓65 V，鞘氣溫度350 ℃，干燥氣和鞘氣流量分別為8、11 L/min，霧化氣壓力35 psi，全掃描模式(100～3000 amu)。

1.2.2 高效液相色譜檢測方法 YMC-Pack C-18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.2%甲酸銨溶液(用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.9)-乙腈(55:45)；流速為0.5 mL/min，檢測波長為258 nm。

1.3 溶液配制 取適量黃霉素對照品，利用50%甲醇溶液溶解并定容至適當?shù)臐舛取?.4 樣品處理 取黃霉素預(yù)混劑適量，加入50%甲醇溶液適量，混勻，置超聲浴中超聲15 min，放冷至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至適當濃度，搖勻，過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法鑒別黃霉素不同組分

圖2 黃霉素標準品的高效液相色譜譜圖

使用《獸藥國家標準》(化學藥品、中藥卷)第一冊中規(guī)定的高效液相色譜方法對黃霉素標準品進行檢測，黃霉素不同組分的檢測結(jié)果如圖2所示。根據(jù)不同組分的極性差異，其保留時間從左到右依次為14.331、15.577、16.699、18.559、19.916 min，對應(yīng)《獸藥國家標準》(化學藥品、中藥卷)第一冊中黃霉素預(yù)混劑檢查要求中的組分1、黃霉素A、組分2、組分3、組分4。上述方法雖然可以鑒別黃霉素的不同組分，但是依據(jù)僅為極性差異，缺少足夠的說服力。目前國外相關(guān)文獻已經(jīng)明確提出了黃霉素五種組分的具體成分及其分子結(jié)構(gòu)[15]，而高效液相色譜法缺少相應(yīng)的技術(shù)手段對黃霉素五種組分進行深入研究。

2.2 超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜鑒別黃霉素不同組分 按照1.3項所示方法對黃霉素標準品溶液進行檢測，黃霉素的質(zhì)譜掃檢測結(jié)果如圖3和表1所示。根據(jù)圖3和表1中的數(shù)據(jù)可以看出，超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜通過黃霉素不同組分的極性差異、精確分子量差異以及二級質(zhì)譜中特征碎片三種技術(shù)手段實現(xiàn)不同組分有效鑒別，較之高效液相色譜法具有更好確定性。

表1 黃霉素標準品檢測結(jié)果

由于兩種鑒別方法使用的色譜柱極性類似、流動相也類似，因此黃霉素不同組分在色譜柱上的保留時間先后順序不會發(fā)生變化，通過其對應(yīng)順序可以判斷《獸藥國家標準》(化學藥品、中藥卷)第一冊中不同組分的具體成分：組分1為黃霉素A12，組分2為黃霉素C1，組分3為黃霉素C3，組分4為黃霉素C4。利用超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜確定黃霉素不同組分的具體成分后，可以有效指導(dǎo)黃霉素的質(zhì)量管理；結(jié)合代謝工程與基因工程技術(shù)也可以有效優(yōu)化黃霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程。

2.3 實際樣品檢測 使用超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜對黃霉素預(yù)混劑進行鑒別檢測，結(jié)果如表2所示，黃霉素不同組分的保留時間、精確分子量、二級質(zhì)譜特征碎片與標準品基本一致，說明該方法可以應(yīng)用于黃霉素的鑒別分析。

表2 黃霉素樣品檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

與傳統(tǒng)液相色譜技術(shù)相比，超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)可以有效提高液相色譜的分析速度、分離效率、樣品通量和靈敏度[16]。高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜在相關(guān)軟件的支持下，可以提供母離子與碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，準確推算可能的分子式，從而進一步對化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證[17-18]。國外利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對黃霉素多組分進行鑒別研究已有文獻報道，但是國內(nèi)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對黃霉素的研究主要集中于黃霉素A組分的定量檢測，對于黃霉素多組分的鑒別研究卻鮮有報道。本研究采用超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜對預(yù)混劑中黃霉素進行分析，通過保留時間、精確分子量和二級質(zhì)譜特征碎片對黃霉素的5種組分進行鑒別；并同時確定了五種組分的具體成分，完善了《獸藥國家標準》關(guān)于高效液相色譜法鑒別黃霉素的相關(guān)內(nèi)容。該方法的建立有利于黃霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制與黃霉素發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)化，因此具有良好的使用價值。

[1] 吳家鑫, 張國棟, 劉曉潔, 等. 聚類分析在黃霉素發(fā)酵過程中的應(yīng)用[J]. 微生物學通報, 2012, 39(6): 865-871.

[2] Kurz M, Guba W, Vertesy L. Three-dimensional structure of moenomycin A-a potent inhibitor of penicillin-binding protein 1b[J]. European Journal of Biochemistry, 1998, 252(3): 500-507.

[3] Welzel P, Wietfeld B, Kunisch F,etal. Moenomycin A: further structural studies and preparation of simple derivatives[J]. Tetrahedron, 1983, 39(9): 1583-1591.

[4] Fehlhaber H W, Girg M, Seibert G,etal. Moenomycin A: A structural revision and new structure-activity reactions[J]. Tetrahedron, 1990, 46(5): 1557-1568.

[5] Donnerstag A, Marzian S, Mueller D,etal. A structurally and biogenetically interesting moenomycin antibiotic[J]. Tetrahedron, 1995, 51(7): 1931-1940.

[6] Scherkenbeck J, Hiltmann A, Hobert K,etal. Structures of some moenomycin antibiotics-inhibitors of peptidoglycan biosynthesis[J]. Tetrahedron, 1993, 49(15): 3091-3100.

[7] Hessler-Klintz M, Hobert K, Biallass A,etal. The first moenomycin antibiotic without the methyl-branched uronic acid constituent-unexpected structure activity relations[J]. Tetrahedron, 1993, 49(35): 7667-7678.

[8] 吳家鑫, 劉曉潔, 齊鵬, 等. 基于主元分析-模糊C均值聚類優(yōu)化黃霉素發(fā)酵過程[J]. 化學工程, 2013, 41(10): 5-8.

[9] 吳家鑫, 張國棟, 齊鵬, 等. 黃霉素發(fā)酵過程的灰色關(guān)聯(lián)度分析及其灰色預(yù)測模型[J]. 化工進展, 2013, 32(6): 1382-1384.

[10]吳家鑫, 張國棟, 齊鵬, 等. 黃霉素工業(yè)化發(fā)酵過程中灰色預(yù)測模型的應(yīng)用[J]. 化工進展, 2013, 32(12): 2957-2960.

[11]楊秀玉, 吳好庭, 張秀英. 高效液相色譜法檢查不同廠家黃霉素中黃霉素A的相對量[J]. 中國獸藥雜志, 2003, 37(12): 22-24.

[12]陳永輝, 劉波, 曾兆國, 等. 黃霉素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中菌絲體內(nèi)外效價的變化研究[J]. 中國獸藥雜志, 2007, 41(5): 27-30.

[13]李金強, 沙美蘭, 李曉玉, 等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中黃霉素A的含量[J]. 中國獸藥雜志, 2012, 47(9): 22-25.

[14]曾兆國, 劉波, 陳永輝, 等. 離子對高效液相色譜法鑒別黃霉素方法的研究[J]. 飼料工業(yè), 2008, 29(8): 46-47.

[15]Zehl M, Pittenauer E, Rizzi A,etal. Characterization of Moenomycin Antibiotic Complex by Multistage MALDI-ITRTOF-MS and ESI-IT-MS[J] Journal of American Society and Mass Spectrometry, 2006, 17(8): 1081-1090.

[16]Li L, Luo G A, Liang Q L,etal. Rapid qualitative and quantitative analyses of Asian ginseng in adulterated American ginseng preparations by UPLC/Q-TOF-MS[J]. Journal Pharmaceutical and Biomedical analysis, 2010, 52(1): 66-72.

[17]孟哲, 石志紅, 呂運開, 等. 超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查乳制品中磺胺類與氟喹諾酮類藥物[J]. 分析化學, 2014, 42(10): 1493-1500.

[18]葉海英, 鄭水慶, 梁晨, 等. LTQ-Orbitrap組合式高分辨質(zhì)譜法快速篩查毛發(fā)中7種毒品及代謝物[J]. 分析化學, 2012, 40(11): 1674-1679.

(編輯：侯向輝)

Indentification of Flavomycin in Premix by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem High Resolution Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

WU Jia-xin1, LIU Min2, SHANG Fei3, QI Peng1, ZHANG Guo-dong1, LIANG Jing-le4

(1.KeyLaboratoryofBiologicalProductsandChemicalDrugsforAnimals,MinistryofAgriculture,BeijingEngineeringResearchCenterofDesign
andDevelopmentofSyntheticPeptideVaccinesforAnimals,ChinaAnimalHusbandryIndustryCoLtd,Beijing100095,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofBioprocess,CollegeofLifeScienceandTechnology,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China;3.AnalysisandTestingCenter,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China;4.ChinaAnimalHusbandryIndustryCoLtd,Beijing100070,China)

Using ultra-performance liquid chromatography-tandem high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry, the discriminant analysis of 5 components of flavomycin in premix was conducted. Based on C18 chromatogram column separation, the acetonitrile - 0.1% formic acid aqueous solution (including 2 mmol/L ammonium acetate) was employed as the mobile phase at flow rate of 0.4 mL/min for gradient elution at column temperature of 40 ℃; Mass spectrometry conditions were electrospray ionization (ESI) operated in negative ion full scan mode. The identification of 5 components of flavomycin were implemented based on retention time, exact molecular weight, and secondary mass spectral characteristic fragments. Compared with high performance liquid chromatography, this method is of better application value for its advantages of accurate judgement and rapid detection.

indentification；flavomycin；ultra-performance liquid chromatography；high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (2011AA10A214)

吳家鑫，高級工程師，從事獸藥研發(fā)工作。E-mail：icebergwujiaxin@163.com

2016-02-24

A

1002-1280 (2016) 05-0024-05

R917