楊文智，李霞霞，王樹根，李海鷹

(河北大學 藥學院，河北 保定　071002)

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格列美脲水凝膠劑體內外透皮釋放的評價

楊文智，李霞霞，王樹根，李海鷹

(河北大學 藥學院，河北 保定071002)

摘要：采用HPLC法檢測自制格列美脲水凝膠的藥物含量，研究凝膠中藥物的體內外透皮釋放．選用小鼠鼠皮，采用Franz立式擴散儀考察水凝膠中藥物的體外釋放，藥物體外釋放接近零級釋放．選用新西蘭兔背敷凝膠，測定兔體內格列美脲的藥-時曲線．考察超聲按摩兔皮后涂敷等量藥物水凝膠，藥物經皮滲透的變化．藥代動力學研究結果表明：對照組血藥質量濃度12 h達峰，ρmax為7.64 μg/mL，持續(xù)釋藥長達48 h．而兔皮超聲后tmax提前至6 h，藥物起效迅速．格列美脲水凝膠體內外釋放呈相關性，即可通過體外釋放狀況預測藥物體內吸收．

關鍵詞：格列美脲；水凝膠；超聲；體內外釋放；透皮吸收

第一作者：楊文智(1972-)，男，內蒙古錫林浩特人，河北大學副教授，從事生物醫(yī)用材料及藥物緩控釋制劑方面研究.E-mail:wenzhi_yang@sina.com

格列美脲是FDA批準的第1個可聯(lián)合胰島素使用的口服降糖藥，屬第3代磺脲類藥物，相比同類其他藥物，具有起效快、作用持久及劑量小等優(yōu)點[1]，市售格列美脲劑型以片劑和膠囊為主．因為格列美脲水溶性差(1.6 μg/mL)，溶出慢，影響其口服劑型發(fā)揮最佳臨床療效[2-3]．另外，口服格列美脲劑型藥物半衰期短，血藥濃度波動大，需長時間用藥，文獻報道患者可出現(xiàn)低血糖癥、胃腸道刺激和視覺障礙等不良反應[4-5]，故改善口服格列美脲固體制劑溶出度的研究，時有報道[6]．透皮給藥制劑，可避免藥物胃腸道反應和肝臟首過效應，維持平穩(wěn)的血藥濃度，制劑使用方便，易被患者接受．而格列美脲難溶，極大限制了其透皮給藥新劑型的開發(fā)．查閱文獻，未見格列美脲水凝膠劑的研究報道．基于此，本實驗首先采用助溶技術解決格列美脲難溶的問題，選擇卡波姆為凝膠基質，制備格列美脲水凝膠劑并考察凝膠劑中藥物體內外釋放，為格列美脲水凝膠處方設計及應用提供實驗支持．

1儀器與試藥

1.1　儀器

LC3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Franz立式雙室擴散儀(中科院上海有機所)；B-629型超聲波美容儀(15W，50-60Hz，吳邦美容美發(fā)設備有限公司)；AN2651型分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；HJ-6型磁力加熱攪拌器(金壇市城東新瑞儀器廠)；TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器廠)；THZ-82型氣浴恒溫振蕩箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XH-C旋渦混合器(金壇市白塔新寶儀器廠)；YQD-6B型氮吹儀(上海亭山儀表廠)．

1.2　試劑

1.3　實驗動物

昆明種小鼠(合格證號：1407010；18~22 g)和新西蘭兔(合格證號：1407011；(2.5±0.1)kg)，由河北省實驗動物中心提供.

2方法與結果

2.1　格列美脲水凝膠劑的制備

精密稱取格列美脲10 g和葡甲胺40 g，加去離子水50 mL，80 ℃水浴加熱至完全溶解，攪拌放冷，得到20 mg/mL的藥物溶液．攪拌條件下，按處方量依次加入氮酮(1%，體積分數(shù))、油酸(1%，體積分數(shù))、尼泊金乙酯(3 mg/mL)、EDTA-2Na(0.1 mg/mL)、甘油(10%，體積分數(shù))，混合均勻．然后加入卡波姆(質量濃度10 mg/mL)，磁力攪拌，充分溶脹后加入三乙醇胺(質量濃度13.5 mg/mL)，攪拌過夜，得到格列美脲水凝膠．

2.2　色譜條件的選擇

2.2.1檢測波長的確定精密稱定格列美脲，配成適宜濃度的藥物甲醇溶液，以甲醇為空白基質，用紫外可見分光光度計進行波長掃描．格列美脲的最大吸收波長為227 nm，且在此波長條件下，葡甲胺和空白基質均無干擾．

2.2.2色譜條件色譜柱：Hypersil BDS C18柱(46 mm × 250 mm，5 μm)，分析柱前接ODS C18保護柱；流動相：甲醇-0.025 mol/L NH4H2PO4溶液(3∶1，體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：227 nm；柱溫：常溫；進樣量：20 μL．

2.3　體外滲透實驗

2.3.1實驗方法采用Franz立式透皮擴散池，透過面積為2.69 cm2，接收池體積為13.0 mL．將處理的離體鼠皮固定于擴散池和接收池間，角質層朝上，確保真皮層與接受液緊密接觸．以乙醇、聚乙二醇和生理鹽水(5∶2∶3，體積比)混合液為接收液．精密稱取格列美脲水凝膠4 g，含藥60 mg，涂于小鼠皮膚表面，水浴溫度(32 ± 0.5)℃，300 r/min攪拌速度，分別于0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36和48 h取出接收液，補充(32±0.5)℃等量接收液．取樣5 000 r/min離心后，進樣測定格列美脲含量．按下列公式分別計算格列美脲的單位面積累積釋放量(Q)和藥物透皮吸收百分率(W%)，其中V為接收池的體積，ρn為第n次取樣時的藥物質量濃度，A為有效透過面積，M為水凝膠含藥總量．

2.3.2標準曲線的建立精密稱取恒重的格列美脲藥物，用甲醇配成1 mg/mL的格列美脲儲備液．稀釋儲備液配制成各濃度的工作液，按2.2.2方法進行分析，以峰面積A對藥物濃度ρ(μg/mL)作圖，得到格列美脲標準曲線為y= 5.8×104x + 3.5×104(R=0.9996；n=5)，線性為0.1~100 μg/mL．紫外掃描顯示，水凝膠基質對藥物測定無干擾，格列美脲保留時間為7.8 min．

圖1　格列美脲水凝膠劑中藥物累積釋放曲線

2.3.3精密度和回收率實驗取一定濃度的格列美脲的對照品溶液，每隔2 h進行測定，連續(xù)測定5次，同一條件下，連續(xù)測定5 d，考察日內和日間精密度．日內RSD為0.20%，日間RSD為0.40%．在制備的凝膠劑中分別添加高(50 μg/mL)、中(5 μg/mL)、低(0.5 μg/mL)3種質量濃度的格列美脲標準液，3種質量濃度各5份，處理后分析測定．計算得到格列美脲的平均回收率為102%．以上結果表明：所建立的色譜法定量準確，方法可靠，可用于體外釋放實驗中格列美脲含量的測定．

2.3.4體外透皮實驗結果根據(jù)公式分別計算格列美脲的單位面積累積滲透量(Q)和藥物透皮吸收百分率(W%)，并以Q對t作圖，如圖1所示．格列美脲在12 h內釋放緩慢，12~48 h釋放迅速，48 h格列美脲累積透過百分率達到處方量的27.2%．

Q~t回歸分析，采用Higuchi方程、零級方程及一級方程進行擬合，選擇相關系數(shù)(R2)最大的模擬方程為最優(yōu)釋放模型．結果見表1，水凝膠中格列美脲更傾向以零級動力學方程經皮滲透，屬于Fick’s擴散滲透機制，水凝膠劑中格列美脲的累積釋放量與時間呈良好的線性相關關系，R2為0.979 3，透皮速率常數(shù)J為124.39 μg/(cm2·h)．

表1　格列美脲水凝膠劑中藥物累積滲透量與時間的擬合方程

處方中以氮酮和油酸為混合促滲劑．文獻報道，2種促滲劑穩(wěn)定性好、對皮膚無毒無刺激、低濃度便可促進滲透[7]．氮酮可改變角質層中脂質雙分子層的致密性并增加其流動性，可減小藥物在角質層中的擴散阻力，促進藥物的透皮吸收[8]．油酸屬于順式不飽和脂肪酸，廣泛存在于自然界及人皮膚角質層中，作為皮膚內源性成分，具有良好的生物相容性[9]．文獻報道油酸與氮酮聯(lián)用能發(fā)揮協(xié)同促透作用[10-11]，故格列美脲水凝膠處方設計選用等量氮酮和油酸混合促透劑，以促進格列美脲透皮吸收．實驗中采用離體小鼠鼠皮，盡量保持小鼠周齡、質量、皮膚選用部位及處理等因素相一致，減小個體差異對藥物滲透的影響[12]．

2.4　兔體內藥代動力學實驗

2.4.1動物分組和給藥選取健康新西蘭兔，雌雄各半，隨機分為正常組和超聲組，每組6只，實驗前12 h禁食不禁水．去除兔背部體毛，保證皮膚無損傷，于正中至兩側劃出5 cm×5 cm區(qū)涂抹給藥，水凝膠均勻涂抹于兔背部其中一側，給藥劑量為18.36 mg/kg．正常組直接背敷水凝膠．超聲組先用無水乙醇濕潤兔背部皮膚，美容儀超聲探頭緊貼兔皮超聲按摩25 min后，涂抹與正常組等量水凝膠．分別于0.5,1,2,4,6,8,12,24,36和48 h兔耳緣靜脈取血0.5 mL，置于裝有肝素鈉的PE管中．采用DAS 2.0軟件計算格列美脲在兔體內的藥動學參數(shù)．

2.4.2血樣的處理將加有肝素鈉抗凝的全血5 000 r/min離心10 min，精密量取上清液20 μL，用1 mol/L的鹽酸20 μL酸化10 min，加入混合有機溶劑(V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=5∶1)1.2 mL，渦旋混合器5 min，8 000 r /min離心10 min，吸取上清液，50 ℃水浴，氮氣吹干．殘余物用50 μL甲醇溶解，12 000 r/min離心10 min，20 μL進樣分析．

a.空白血漿；b.血漿樣品；c.空白血漿加對照品.圖2　格列美脲血樣HPLC色譜Fig.2　HPLC spectrum

組別ρmax/(g·mL-1)Tmax/hAUC0-48/(g·h·mL-1)超聲組7.616210.45正常組7.6412216.71

a.超聲組；b.正常組.

2.5　體內外相關性

各時間點下格列美脲凝膠劑的兔體內藥物累積AUC(Y)和體外單位面積藥物累積滲透量(X)見表3．

表3　各時間點下格列美脲的體內外累積釋放

以Y對X作圖，見圖4，得到回歸方程Y= 0.039X+5.983，r=0.985．對相關系數(shù)r進行顯著性檢驗，統(tǒng)計量t=r(n-2)1/2/(1-r2)1/2=17.12 >t0.001(10)=4.59，表明格列美脲水凝膠具備顯著的動物體內外相關性，即通過測定格列美脲凝膠劑中藥物體外釋放情況可預測涂敷凝膠劑后藥物在兔體內吸收狀況，故獲得實驗數(shù)據(jù)可指導格列美脲水凝膠劑的臨床應用．

圖4　格列美脲體內累積AUC與體外單位面積累積滲透量的線性回歸Fig.4　Linear regression plot of accumulated absorbed in vivo versus accumulated released in vitro

3結論

考察了格列美脲水凝膠劑中藥物的體外釋放和兔體內吸收，采用HPLC檢測樣品，分析方法可靠、準確．格列美脲水凝膠劑采用離體鼠皮的體外透皮實驗顯示，藥物透皮接近零級釋放，以恒定速率124.39 μg/(cm2·h)釋放藥物，48 h藥物累積滲透約為處方量27%．兔體內藥代動力學曲線表明，涂敷自制格列美脲水凝膠后，48 h內持續(xù)釋放藥物，具有緩釋和長效作用．低頻超聲處理兔皮后涂敷等量格列美脲凝膠劑，顯著縮短藥物達峰時間，促進藥物快速吸收．格列美脲水凝膠劑體內外釋放呈現(xiàn)顯著相關性，實驗數(shù)據(jù)可為格列美脲水凝膠劑處方設計提供支持．

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(責任編輯：梁俊紅)

Drug release evaluation of glimepiride hydrogelinvitroandinvivo

YANG Wenzhi, LI Xiaxia, WANG Shugen, LI Haiying

(College of Pharmacy，Hebei University，Baoding 071002，China)

Abstract:In order to study and evaluate the release behavior of glimepiride(GM)hydrogel in vitro and in vivo, an HPLC method was used to determine the drug concentration in the hydrogel. The in vitro transdermal permeation behaviors of GM through mice skin were studied using Franz-type diffusion cell. The results showed that the drug released from hydrogel fitted with zero-order kinetic characteristics. A pharmacokinetic study of glimepiride hydrogel was carried out using New Zealand rabbits, and compared with the ultrasonic wave processing rabbit skin. It demonstrated that in the control group, the hydrogel could sustain release glimepiride for 48 h, and plasma drug mass concentration reached a peak(ρmax, 7.64 μg/mL) after 12 h. After an ultrasonic pretreatment, there was an earlier tmaxat 6 h．It was evident that ultrasonic could promote drug permeation. There was a good correlation between in vitro skin permeation and in vivo transdermal absorption using hydrogel, and the GM release in vitro could well predict its absorption in vivo.

Key words:glimepiride；hydrogel；ultrasonic；in vitro and in vivo；percutaneous absorption

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(H2012201069；H2016201044)；河北省科技計劃項目(13272705)

收稿日期：2015-01-15

中圖分類號：O658

文獻標志碼:A

文章編號：1000-1565(2015)06-0599-06

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.008