武金霞，劉青，劉禹杉，王靜之，張賀迎

(1. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定　071002；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定　071002)

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蠅蛆肽的發(fā)酵法制備及其對(duì)果蠅的延壽作用

武金霞1，劉青1，劉禹杉1，王靜之1，張賀迎2

(1. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定071002)

摘要：以米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀3.042轉(zhuǎn)化蠅蛆蛋白，蠅蛆蛋白的主要組分91.8 ku蛋白經(jīng)發(fā)酵后被降解，轉(zhuǎn)化形成了分子質(zhì)量為4.3~65.9 ku的蠅蛆肽，發(fā)酵液中蠅蛆肽質(zhì)量濃度為7.9 mg/mL，肽轉(zhuǎn)化率為31.6%.在飼喂雌雄黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加蠅蛆肽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，1%，2%，4%，每天分組記錄果蠅的死亡數(shù)目和存活時(shí)間，直至果蠅全部自然死亡.結(jié)果表明，飼喂高濃度蠅蛆肽的雌雄果蠅的平均壽命和平均最高壽命均顯著延長(zhǎng)，提示蠅蛆肽具有一定的抗衰老作用.

關(guān)鍵詞：蠅蛆肽；黑腹果蠅；最高壽命；抗衰老作用

第一作者：武金霞(1966-)，女，河北曲陽(yáng)人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事生化藥物及基因工程藥物研究.

E-mail：wjx6@163.com

E-mail：z660128@163.com

家蠅(Muscadomestica) 能在極其惡劣的環(huán)境中生存，與其表達(dá)抗菌肽、抗菌蛋白及抗病毒成分有關(guān)[1-3]，研究表明家蠅幼蟲(chóng)(Muscadomesticalarvae)即蠅蛆浸提液還具有抗氧化、抗輻射等作用[4-5].蠅蛆不但含有許多活性成分，還是優(yōu)質(zhì)蛋白資源，其粗蛋白含量達(dá)59%~65%[6-7]，目前蠅蛆多用來(lái)部分替代魚(yú)粉做蛋白質(zhì)飼料飼喂畜禽[8-9].受傳統(tǒng)飲食習(xí)慣的影響，人們直接食用蠅蛆原形態(tài)產(chǎn)品受到一定限制，目前僅有少數(shù)作者研制了蠅蛆蛋白飲料和果凍[10-11].將蛋白質(zhì)限制性降解，可得到外源性生物活性肽，經(jīng)腸道吸收后發(fā)揮各種生理功能.有報(bào)道稱投喂利用酶解法轉(zhuǎn)化蠅蛆制備的蠅蛆肽，可提高大鼠免疫力和改善小鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況[12-13].本研究以米曲霉(Aspergillusoryzae)發(fā)酵蠅蛆蛋白制備了蠅蛆肽，并研究了蠅蛆肽對(duì)果蠅的延壽作用，為深度開(kāi)發(fā)蠅蛆蛋白資源提高其附加值提供了新的思路.

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1材料及試劑

新鮮蠅蛆(河北大學(xué)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)；黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(河北大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供).牛血清白蛋白、低分子質(zhì)量蛋白Marker、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、Tris、Tricine均購(gòu)自Sigma公司.

1.1.2儀器

高速冷凍離心機(jī)(Sigma 公司)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(DYY-16D型，北京市六一儀器廠)；冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Best 300M(GOLD-SIM公司)；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(GL20A，湘西儀器儀表總廠).

1.2　方法

1.2.1蠅蛆浸提原液的制備及檢測(cè)

稱取一定量新鮮蠅蛆，按每g蠅蛆加4 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)的比例加入緩沖液,組織搗碎機(jī)搗碎， 4 ℃冰箱浸提10 h，12 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液為蠅蛆浸提原液，多次浸提原液合并冷凍干燥后備用.以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以Folin-酚法測(cè)定蠅蛆浸提原液的蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE檢測(cè)蠅蛆浸提原液中蠅蛆蛋白組分，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%.

1.2.2米曲霉發(fā)酵蠅蛆蛋白制備蠅蛆肽

以蒸餾水溶解蠅蛆浸提原液凍干粉(唯一氮源)，使蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為25.0 mg/mL，每100 mL加入2 g葡萄糖，0.1 MPa滅菌30 min.接種米曲霉孢子，32 ℃，180 r/min，震蕩培養(yǎng).每隔24 h取樣，6 000 r/min離心除去菌絲體，得上清液，以0.5 mol/L三氯乙酸沉淀大分子蛋白，靜置30 min后再次離心，得上清液，再以雙縮脲法測(cè)定上清液中蠅蛆肽的含量.Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)蠅蛆肽的分子質(zhì)量分布.

1.2.3蠅蛆肽對(duì)果蠅的延壽作用

2結(jié)果

2.1　蠅蛆浸提原液的蛋白組分分析

在上述實(shí)驗(yàn)條件下得到的蠅蛆浸提原液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為9.88 mg/mL，其蛋白質(zhì)組分見(jiàn)圖1.

由圖1可知，蠅蛆浸提原液中以分子質(zhì)量為91.8 ku 的條帶含量最高，還有一些分子質(zhì)量較小的肽，但含量很低，91.8 ku組分是蠅蛆浸提原液中的主要蛋白質(zhì)組分.

2.2　米曲霉發(fā)酵制備的蠅蛆肽的分子質(zhì)量分布檢測(cè)

米曲霉發(fā)酵蠅蛆蛋白過(guò)程中蠅蛆肽形成曲線如圖2.

1.蠅蛆浸提原液；2.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).

圖2　米曲霉發(fā)酵過(guò)程中蠅蛆肽質(zhì)量濃度曲線

由圖2可知，發(fā)酵24 h發(fā)酵液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度急劇下降，肽的質(zhì)量濃度與最初相比也有所降低，是由于米曲霉利用蠅蛆浸提原液中蛋白質(zhì)和肽作為氮源生長(zhǎng)所致.隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，米曲霉逐漸生長(zhǎng)，肽的形成逐漸增多，當(dāng)發(fā)酵96 h時(shí)蠅蛆肽的質(zhì)量濃度達(dá)到最高為7.9 mg/mL，肽轉(zhuǎn)化率達(dá)31.6%.發(fā)酵120 h 蠅蛆肽的質(zhì)量濃度稍有下降，144 h 蠅蛆肽質(zhì)量濃度有所提高，達(dá)7.5 mg/mL，繼續(xù)發(fā)酵，則米曲霉菌絲體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，菌體細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放，因此選取發(fā)酵96 h制取蠅蛆肽.

SDS-PAGE 及Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)米曲霉發(fā)酵后蠅蛆蛋白轉(zhuǎn)化為蠅蛆肽的組分及分子質(zhì)量分布(圖3，4).

1-6.發(fā)酵24 ，48 ，72 ，96 ，120 ，144 h的蠅蛆浸提液.

由圖3可知，發(fā)酵24 h 時(shí)幾乎檢測(cè)不到蠅蛆肽，是因?yàn)槊浊乖跓o(wú)其他氮源情況下利用蠅蛆蛋白生長(zhǎng)繁殖所致.隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，米曲霉不斷將蠅蛆蛋白降解轉(zhuǎn)化，形成分子質(zhì)量較小的蠅蛆肽.發(fā)酵144 h，形成a-h 8條明顯的條帶，分子質(zhì)量分別為65.9，49.8，49.2，44.7，29.8，25.8，25.6，22.4 ku.SDS-PAGE不能檢測(cè)到分子質(zhì)量幾ku的肽類，Tricine-SDS-PAGE可以彌補(bǔ)其不足，用來(lái)檢測(cè)是否有更小的肽類形成，見(jiàn)圖4.

1.蠅蛆浸提原液；2-7.發(fā)酵24，48，72 ，96 ，120 ，144 h的蠅蛆浸提液.

圖4顯示，米曲霉發(fā)酵96~144 h，夾層膠能檢測(cè)到a，b，c 3個(gè)肽，分子質(zhì)量分別為21.2,15.6，10.9 ku；致密膠中顯示發(fā)酵96 h產(chǎn)生e，f條帶，發(fā)酵120 h和144 h產(chǎn)生d，f條帶，條帶d,e,f的分子質(zhì)量分別為5.9，5.0， 4.3 ku.結(jié)合圖3可知，蠅蛆蛋白主要成分91.8 ku大分子質(zhì)量蛋白，經(jīng)米曲霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化為分子質(zhì)量分布從4.3 ku到65.9 ku的蠅蛆肽，說(shuō)明蠅蛆肽種類豐富且轉(zhuǎn)化率很高.

2.3　蠅蛆肽對(duì)果蠅的延壽作用

圖5顯示，對(duì)照組雌性果蠅的最少存活時(shí)間為34 d，半數(shù)存活時(shí)間為53 d，該組最高壽命為59 d；飼喂低、中、高質(zhì)量濃度蠅蛆肽的雌性果蠅最少存活時(shí)間分別為38，36，43 d，與對(duì)照組相比延長(zhǎng)了4，2，9 d，半數(shù)存活時(shí)間為56，58，66 d，延長(zhǎng)了3，5，13 d，最高壽命為78，76，82 d，延長(zhǎng)了8，17,23 d.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，用高質(zhì)量濃度蠅蛆肽飼喂的雌性果蠅顯著地延長(zhǎng)了平均存活時(shí)間和最高壽命.

圖6可知，對(duì)照組雄性果蠅的最少存活時(shí)間為33 d，半數(shù)存活時(shí)間為51 d，其最高壽命為61 d；飼喂低、中、高質(zhì)量濃度蠅蛆肽的雄性果蠅最少存活時(shí)間分別為35，36，45 d，與對(duì)照相比延長(zhǎng)了2，3，12 d，半數(shù)存活時(shí)間為51，63，66 d，延長(zhǎng)了0，12，15 d,最高壽命為74，77，82 d，延長(zhǎng)了13，16，21 d，用高質(zhì)量濃度蠅蛆肽飼喂的雄性果蠅顯著地延長(zhǎng)了平均存活時(shí)間和最高壽命.

圖5　蠅蛆肽對(duì)雌果蠅的延壽作用

圖6　蠅蛆肽對(duì)雄果蠅的延壽作用

3討論

米曲霉是安全的傳統(tǒng)釀造微生物，具有很高的蛋白酶活力，在米曲霉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生豐富的蛋白酶將蠅蛆蛋白降解為分子質(zhì)量大小不同的蠅蛆肽，發(fā)酵和酶解同步完成，與單純酶解法相比具有成本低、轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn).本研究中，米曲霉發(fā)酵96 h蠅蛆肽的轉(zhuǎn)化率達(dá)31.6%.飼喂蠅蛆肽之后，雌雄果蠅的平均壽命和平均最高壽命均有顯著延長(zhǎng)，提示蠅蛆肽具有一定的抗衰老作用.米曲霉蛋白酶具有較廣泛的底物特異性，發(fā)酵過(guò)程中除了形成蠅蛆肽之外，還形成少量游離氨基酸，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)和游離氨基酸成分主要為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)，因此可以認(rèn)為起延緩衰老作用的是蠅蛆肽.衰老作為與生命體氧化損傷有關(guān)的復(fù)雜的生命現(xiàn)象，是由于機(jī)體代謝產(chǎn)生的活性氧成分造成的損傷累積引起的[15]，衰老進(jìn)程中能量代謝與物質(zhì)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)降低，導(dǎo)致機(jī)體代謝能力下降，蠅蛆肽的抗衰老作用究竟與其調(diào)節(jié)哪些基因的表達(dá)有關(guān)，值得深入研究.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Preparation ofMuscadomesticalarvae peptides

by fermentation and its anti-aging effects

WU Jinxia1, LIU Qing1, LIU Yushan1, WANG Jingzhi1, ZHANG Heying2

(1. College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002,China;

2. Research Center of Biotechnology, Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract:The main protein component of 91.8 ku extracted from Musca domestica larvae was degraded into smaller peptides which molecular weight was from 4.3 to 65.9 ku after fermentation by Aspergillus oryzae and the mass concentration of peptides in fermentation liquor was 7.9 mg/mL，the conversion rate was 31.6%. Male and female Drosophila melanogaster was divided into four groups randomly and fed with culture media containing 0, 1%，2%，4% of the peptides lyophilized powder . The death number and the survival days of D. melanogaster was recorded every day until all the D. melanogaster died. The results showed that the average life span and average maximum life span of male and female D. melanogaster was increased significantly, suggesting the M. domestica larvae peptides possessed anti-aging effects.

Key words:Musca domestica larvae peptides; Drosophila melanogaster; maximum life span; anti-aging effects

通信作者：張賀迎(1966-)，男，河北大城人，河北大學(xué)副研究員，主要從事生化藥物及基因工程藥物研究.

基金項(xiàng)目：河北省生物工程重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(1050-5030023)；河北省生物學(xué)強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科資助項(xiàng)目.

收稿日期：2015-04-12

中圖分類號(hào)：Q936;Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000-1565(2015)06-0605-05

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.009