關(guān)鑫，董明巖，于洋，高博(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、脊髓組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá)變化

關(guān)鑫，董明巖，于洋，高博
(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

摘要:目的觀察缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、脊髓組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá)變化，并探討其意義。方法將60只SD大鼠隨機(jī)分為實驗組、假手術(shù)組和空白組，各20只。實驗組采用經(jīng)典Zivin法復(fù)制模型，動脈夾結(jié)扎左腎下腹主動脈1 h，制備脊髓缺血再灌注模型;假手術(shù)組只做左側(cè)肋骨下緣切口，不結(jié)扎腹主動脈;空白組不做任何處理。三組分別于缺血再灌注后6、12、24、48 h，電鏡觀察脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況，Western blotting法檢測脊髓組織X-盒結(jié)合蛋白1( XBP1)及C-JNK氨基末端激酶(磷酸化JNK)蛋白。結(jié)果與假手術(shù)組及空白組相比，實驗組缺血再灌注6、12、24、48 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量多。假手術(shù)組及空白組可檢測到少量表達(dá)的XBP1及磷酸化JNK蛋白。實驗組再灌注6 h后，缺血再灌注梗死灶周圍可以觀察到明顯表達(dá)的XBP1及磷酸化JNK蛋白，缺血再灌注12 h后兩種蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達(dá)。結(jié)論缺血再灌注損傷大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量增加、脊髓組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典標(biāo)志物XBP1及磷酸化JNK蛋白的表達(dá)增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了脊髓缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;脊髓缺血再灌注; X-盒結(jié)合蛋白1; C-JNK氨基末端激酶

脊髓缺血再灌注損傷［1］在臨床上十分常見，以往認(rèn)為缺血再灌注損傷的主要方式是細(xì)胞壞死，但最新研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷的主要方式是由細(xì)胞的凋亡引起的。過去認(rèn)為介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡的途徑分別是線粒體途徑和死亡受體途徑［2］，近幾年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的新途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是合成蛋白質(zhì)，并進(jìn)行修飾、折疊，將加工后的成熟蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境必須維持在穩(wěn)定平衡狀態(tài)，以保證蛋白質(zhì)的最佳折疊狀態(tài)，這種平衡一旦遭到破壞將導(dǎo)致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［4］。本研究采用透射電鏡檢測脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況，并應(yīng)用Western blotting法觀察了大鼠脊髓缺血再灌注后不同時間點(diǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典標(biāo)志物X-盒結(jié)合蛋白1( XBP1)及C-JNK氨基末端激酶(磷酸化JNK)蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康SD大鼠60只，雌雄不限，200～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器磷酸化JNK多克隆抗體、XBP1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司; SABC免疫組化試劑盒、DAB染色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;無水乙醇;多聚甲醛;二甲

苯;石蠟切片機(jī);生物研究顯微鏡( BM-E) ;顯微生物照相顯微鏡。

1.3大鼠脊髓缺血再灌注模型制備及分組所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)，術(shù)前8 h禁食水。采用單純隨機(jī)抽樣方法將所有大鼠分為實驗組、假手術(shù)組和空白組，每組20只。用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量進(jìn)行腹腔注射麻醉。實驗組大鼠均采用經(jīng)典Zivin法復(fù)制模型，從大鼠左側(cè)肋骨下緣肋中線向下開口約3 cm，找到腹主動脈，用動脈夾夾閉1 h。1 h后松開動脈夾，檢查所有大鼠腹腔無滲血后，用慶大霉素8萬U沖洗腹腔，并逐層關(guān)腹。假手術(shù)組只做左側(cè)肋骨下緣切口，不結(jié)扎腹主動脈，1 h后逐層關(guān)腹?？瞻捉M不做任何處理。各組在模型制備后的6、12、24、48 h每個時間點(diǎn)取5只大鼠，沿劍突打開胸腔暴露其心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈內(nèi)，剪開右心耳，灌流固定。灌注完畢，立即取腰膨大以下段脊髓組織，將其分別浸入4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛磷酸緩沖液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4各組大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況觀察取出2.5%戊二醛磷酸緩沖液里的脊髓組織，將其切成約1 mm3的組織塊。再次浸入2.5%戊二醛中固定2 h，1%鋨酸固定2～3 h，常規(guī)梯度乙醇脫水后，純丙酮+包埋液( 2∶1)包埋，超薄切片，電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況并做各組凋亡細(xì)胞的定量分析。用投射電鏡先在低倍下辨認(rèn)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞并將其分布按網(wǎng)孔繪于坐標(biāo)紙上，在3 000倍下，拍攝每組各時間點(diǎn)照片，每個時間點(diǎn)20張，計算照片上凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.5各組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白檢測采用Western blotting法。直接快速取出各時間點(diǎn)的大鼠冰上腰膨大以下0.1 g脊髓，離心取上清液。充分變性蛋白，冷卻到室溫后，放入電泳裝置。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。1∶400稀釋的XBP1一抗和1∶400稀釋的磷酸化JNK一抗4℃孵育過夜。1∶2 000稀釋的二抗在側(cè)擺搖床上緩慢搖動室溫孵育l h。運(yùn)用Quantityone4.6.2( Bio.Rad，美國)凝膠圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況空白組及假手術(shù)組檢測到少量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整;實驗組檢測到大量凋亡細(xì)胞存在。正常神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核核膜完整，細(xì)胞核染色質(zhì)顆粒均勻一致;實驗組缺血再灌注6 h后，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，核膜不完整，核仁偏移;而再灌注12 h后，脊髓神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)固縮，并且呈斑塊狀聚集于核膜周圍，并出現(xiàn)透明的空泡，但神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚完整; 24、48 h仍有較多凋亡神經(jīng)細(xì)胞。三組大鼠各時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較見表1。

表1　三組大鼠各時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較(±s)

表1　三組大鼠各時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較(±s)

注:與空白組及假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

組別　細(xì)胞凋亡6 h　12 h　24 h　48 h空白組9.25±1.12　 8.56±0.04　 9.67±0.87　 6.38±1.65假手術(shù)組　9.31±1.23　 9.26±1.02　 8.23±0.59　 5.34±2.82實驗組　19.43±2.03*82.62±1.15*42.51±0.83*40.46±1.26*

2.2各組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達(dá)比較假手術(shù)組及空白組可檢測到少量表達(dá)的XBP1及磷酸化JNK蛋白。實驗組再灌注6 h后，缺血再灌注梗死灶周圍可以觀察到明顯表達(dá)的XBP1及磷酸化JNK蛋白，缺血再灌注12 h后兩種蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達(dá)。詳見圖1和表2。

圖1　各組磷酸化JNK、XBP1蛋白Western blotting法檢測結(jié)果

表2　三組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2　三組大鼠脊髓組織磷酸化JNK、XBP1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

注:與空白組及假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

組別　　磷酸化JNK蛋白　XBP1蛋白空白組6 h　0.52±0.13　0.12±0.01 12 h　0.48±0.12　0.18±0.11 24 h　0.65±0.16　0.33±0.02 48 h　0.45±0.11　0.45±0.04假手術(shù)組6 h　0.49±0.15　0.11±0.03 12 h　0.58±0.15　0.16±0.02 24 h　0.58±0.12　0.23±0.09 48 h　0.42±0.14　0.34±0.02實驗組6 h　4.98±1.08*　3.78±1.08*12 h　9.68±3.24*　8.43±1.35*24 h　7.86±1.58*　7.14±1.12*48 h　7.45±1.56*　6.24±1.24*

3　討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的

新途徑［5，6］，在應(yīng)激的早期可以通過促進(jìn)錯誤折疊的蛋白轉(zhuǎn)化來保護(hù)機(jī)體，因此早期的干預(yù)應(yīng)激反應(yīng)是治療再灌注損傷的關(guān)鍵。但繼續(xù)應(yīng)激會引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，進(jìn)一步引起某些蛋白和分子伴侶合成減少，即為未折疊蛋白反應(yīng)( UPR)［7］。UPR通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的肌醇需求激酶1( IRE1)、PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶( PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子6 ( ATF6)等三個應(yīng)激感受蛋白，調(diào)節(jié)未折疊或錯誤折疊蛋白［8］。這三個蛋白的信號通路可激活下游的信號分子XBP1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)水平低時，只能通過ATF6的蛋白水解活化來適應(yīng)刺激，而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激處于高水平時，XBP1 mRNA的誘導(dǎo)由ATF6和IRE1共同參與，從而產(chǎn)生高活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1-S，XBP1-S進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合形成異源二聚體，隨后進(jìn)行了一系列的反應(yīng)，以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［9，10］。當(dāng)應(yīng)激刺激過強(qiáng)或時間過長時，XBP1-S可以進(jìn)一步激活其自身的啟動子，ATF6-XBP1-S也可以通過進(jìn)一步活化XBP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄形成，失去對應(yīng)激反應(yīng)的處理能力，造成大量折疊蛋白的聚集，引起組織的損傷。損傷后的主要表現(xiàn)是神經(jīng)功能的缺陷及喪失，從而引起相應(yīng)的功能障礙［11］。JNK信號通路是1991年發(fā)現(xiàn)的一類MAPK通路。JNK最初被發(fā)現(xiàn)是一種特異性磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C-JNK的激酶［12］。JNK MAPK信號通路存在于多種生命過程，是細(xì)胞的生長分化和死亡的關(guān)鍵路徑之一。多種信號可活化JNK途徑，如生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞環(huán)境應(yīng)激等［13］。當(dāng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，Ire1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被激活，激活后與GRP78分離，其次結(jié)合TRAF2和ASK1，進(jìn)而形成Irel/TRAF2/ASK1復(fù)合體，進(jìn)一步活化JNK通路，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［14］。可見，JNK在應(yīng)激反應(yīng)中起著非常重要的作用，從而參與應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞調(diào)亡。目前國內(nèi)外研究已證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了多種常見疾病如視網(wǎng)膜病變、心腦組織缺血和神經(jīng)系統(tǒng)變性、肝炎等疾病的發(fā)病過程，在脊髓缺血再灌注損傷中也有相關(guān)的研究，但磷酸化JNK和XBPI蛋白在脊髓神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)激凋亡的機(jī)制未見相關(guān)報道。

本研究結(jié)果表明，脊髓缺血再灌注損傷大鼠缺血再灌注6 h后，出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)細(xì)胞損傷性改變，隨再灌注時間的延長而增加，12 h達(dá)高峰，24、48 h略有下降;且脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達(dá)出現(xiàn)增高的趨勢，在12 h達(dá)到高峰，24 h稍有回落，48 h仍有較高表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動后，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自身保護(hù)作用發(fā)揮重要作用，此時磷酸化JNK和XBPI的表達(dá)尚低，神經(jīng)細(xì)胞可適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)的刺激而存活，后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時間過長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，磷酸化JNK和XBPI大量表達(dá)啟動細(xì)胞的凋亡途徑，引起脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了脊髓缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)脊髓組織磷酸化JNK和XBPI蛋白表達(dá)有關(guān)。

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收稿日期:( 2015-04-04)

通信作者:董明巖

基金項目:遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目( 2013225305)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0027-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R744

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.010