于中飛+劉魯英

[摘要] 目的 探討白蘆藜醇對糖尿病小鼠腎臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。 方法 8周齡C57bl/6小鼠腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型。將實驗動物分為正常對照組、糖尿病未治療組和糖尿病白蘆藜醇治療組。建模5個月后取腎臟組織行Western blot和RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵分子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein， CHOP）與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein78，GRP78）表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)染色觀察腎臟組織CHOP的表達(dá)。結(jié)果 糖尿病白蘆藜醇治療組CHOP和GRP78表達(dá)水平相比糖尿病未治療組明顯減少（P<0.05），但兩者均高于正常對照組（P<0.05）。 結(jié)論 白藜蘆醇能明顯降低糖尿病小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病 白蘆藜醇 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-4062（2016）12（b）-0072-03

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，作為糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一[1]，糖尿病腎病已經(jīng)成為糖尿病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。隨著我國糖尿病發(fā)病率的上升，糖尿病腎病目前已成為僅次于各種腎小球腎炎的終末期腎臟病的第2位原因[1-2]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制主要包括糖代謝紊亂所致的炎癥損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，氧化應(yīng)激以及血流動力學(xué)異常等[1-3]。由于其存在復(fù)雜的代謝紊亂，加之全身情況的異常，糖尿病腎病一旦發(fā)展到終末期，其治療往往比其他腎臟疾病更加棘手，因此及時防治對于延緩糖尿病腎病的進(jìn)展意義重大。在該研究中，通過對糖尿病小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，旨在探索白蘆藜醇治療對糖尿病腎病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

8周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠（濟(jì)南鵬悅動物有限公司）50只，分為3組：正常對照組（10只），糖尿病未治療組（20只），糖尿病白蘆藜醇治療組（20只，于造模成功后1個月起每天給予白蘆藜醇灌胃40 mg/kg）。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ），兔抗小鼠CHOP和GRP78抗體，兔抗小鼠GAPDH抗體、Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG， RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.3 糖尿病小鼠造模

造模前C57bl/6小鼠過夜禁食，次日開始連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲菌素（STZ）50 mg/kg。注射完成后7 d，采用割尾法取血，快速血糖儀檢測血糖，血糖值大于15.7 mmol/L為造模成功。每月進(jìn)行監(jiān)測血糖，不合格者淘汰出該實驗。

1.4 基因檢測

RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵因子CHOP和GRP78的基因表達(dá)水平各組小鼠過量麻醉處死后，迅速取新鮮腎臟膜組織?？俁NA提取以及逆轉(zhuǎn)錄均按照提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明步驟進(jìn)行操作?；虮磉_(dá)水平相對定量采用2-ΔΔCT法分析。

引物序列：CHOP： F5‘-AGGAGGTCCTGTCCTCAGATGA-3，R 5‘-ATGTGCGTGTGACCTCTGTTG-3；GRP78：F 5‘- CTCCGGCGTGAGGTAGAAAA -3，R 5‘- AGAGCGGAACAGGTCCATGT -3；GAPDH：F： 5- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG -3；R： 5- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG -3

1.5 Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵因子CHOP和GRP78的蛋白表達(dá)水平

取新鮮腎臟組織。提取蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜。一抗（CHOP---1：500，GRP78---1：500，GAPDH---1：2 000），4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記二抗（1：5 000），室溫孵育2 h。膠片顯影照相。

1.6 免疫熒光檢測

免疫組織化學(xué)染色觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵因子CHOP和GRP78的表達(dá)取各組小鼠腎臟組織行冰凍切片，厚度為10 μm。常規(guī)免疫熒光法檢測。一抗為兔抗CHOP和GRP78抗體（1：100， 體積分?jǐn)?shù)1%BSA+抗體，），二抗為Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG（1：100，體積分?jǐn)?shù)1%BSA+抗體），細(xì)胞核染色為DAPI（1：5 000），封片后激光共聚焦熒光顯微鏡拍照。

1.7 統(tǒng)計方法

使用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以平均值±平均差（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血糖和體重情況

3組小鼠取材前，血糖和體重檢測數(shù)據(jù)見表1（各實驗組小鼠已剔除血糖不合格者）。糖尿病組和白蘆藜醇治療組血糖水平明顯高于正常組（P<0.05），而體重相比正常組明顯減輕（P<0.05）。

2.2 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78 mRNA相對表達(dá)量

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)量明顯低于糖尿病未治療組，但兩者都高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

2.3 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78 蛋白表達(dá)量

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP和GRP78的蛋白表達(dá)水平明顯低于糖尿病未治療組，但兩者都高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。

2.4 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78蛋白免疫熒光

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP蛋白紅色熒光染色強(qiáng)度較糖尿病未治療組降低，但兩者熒光強(qiáng)度均高于正常組，見圖3。

3 討論

隨著糖尿病發(fā)病率的升高，其相關(guān)并發(fā)癥也越來越受到人們的重視。糖尿病腎病為其最主要的并發(fā)癥之一，近年來一直是研究的熱點(diǎn)。糖尿病腎病作為一種慢性進(jìn)行性疾病，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)鍵在于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)遭到破壞。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種廣泛存在于細(xì)胞中的細(xì)胞器，對蛋白質(zhì)的合成加工起到十分重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)本身正常功能的維持具有極強(qiáng)的內(nèi)在體系，當(dāng)遭到其他有害因素刺激時則會發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS，endoplasmic reticulum stress）。ERS在生理病理條件下的作用有明顯差異，一定程度的ERS可能對細(xì)胞起保護(hù)作用，但是過度的ERS會加劇細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡[4]。

機(jī)體在糖尿病狀態(tài)下造成ERS可能的刺激因素包括高血糖，炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，蛋白尿以及細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)紊亂等。目前關(guān)于糖尿病腎病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在緊密關(guān)系的證據(jù)已經(jīng)得到闡述[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素B細(xì)胞功能缺陷密切相關(guān)[7]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞用高糖刺激后，ERS相關(guān)指示因子 （CHOP、GRP78、氧調(diào)節(jié)蛋白150等）的表達(dá)均出現(xiàn)明顯升高；臨床檢測中也發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者的腎組織中GRP78、氧調(diào)節(jié)蛋白150表達(dá)明顯增加，提示ERS的發(fā)生和腎臟損傷的程度有關(guān)[8]。

白蘆藜醇作為一種多酚化合物，具有抗氧化，清除自由基和抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種藥理活性作用，對人體多個器官起到保護(hù)作用[9-10]。但白藜蘆醇對糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制中，扮演的阻斷或減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尚無較深入的研究。該研究中，驗證了白蘆藜醇對糖尿病腎病的保護(hù)作用，檢測了與其密切相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。結(jié)果顯示，白蘆藜醇可以明顯降低糖尿病腎臟組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。當(dāng)然，該研究僅初步探索了白蘆藜醇降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥理作用，其關(guān)鍵機(jī)制還未闡明。后續(xù)，將對白蘆藜醇的相關(guān)機(jī)制原理做進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2016-10-23）