羅湘玉，羅衛(wèi)民，張軍，林稱意，郭家龍(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

miR-222基因轉(zhuǎn)染對人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲的影響

羅湘玉，羅衛(wèi)民，張軍，林稱意，郭家龍
(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

摘要:目的miR-222基因轉(zhuǎn)染對人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲的影響。方法采用qRT-PCR檢測miR-222在A549、16HBE細胞中的表達;將miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA與si-control分別轉(zhuǎn)染于A549細胞(設(shè)為實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組)，Western blotting法檢測細胞中的TIMP3蛋白，MTT法和Transwell侵襲實驗分別檢測細胞增殖與侵襲能力。結(jié)果miR-222在A549、16HBE細胞的表達分別為0.767±0.086、0.405 ±0.034，兩者比較，P＜0.01。實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組A549細胞中TIMP3蛋白表達分別為0.416 ±0.023、0.732±0.019、0.430±0.020與0.803±0.025，實驗1組與實驗2組比較，實驗3組與實驗4組比較，P均＜0.05。在A549細胞中過表達miR-222或沉默TIMP3 48、72、96 h后，細胞的增殖能力明顯增強( P均＜0.05)。實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組A549細胞48 h后穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)分別為( 104±5)、( 204±8)、( 99± 4)、( 188±7)個，實驗1組與實驗2組比較，實驗3組與實驗4組比較，P均＜0.05。結(jié)論miR-222基因轉(zhuǎn)染的人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲能力增強，其可能與miR-222靶向調(diào)控TIMP3作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞:微小核糖核酸222;肺腫瘤;非小細胞肺癌;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3;細胞增殖;細胞侵襲

Effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human non-small-cell lung cancer cells

LUO Xiang-yu，LUO Wei-min，ZHANG Jun，LIN Chen-yi，GUO Jia-long
( Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China)

Abstract:Objective To investigate the effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human nonsmall-cell lung cancer cells.Methods The qRT-PCR was employed to detect the expression of miR-222 in A549 and 16HBE cells.The miR-222 mimics，scramble，TIMP3-siRNA and si-control sequence were transfected into A549 cells ( experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4)，respectively.Western blotting was used to detect the expression of TIMP3 protein.The proliferation and invasion abilities were evaluated by MTT and Transwell invasion assay.Results The expression of miR-222 in A549 cells and 16HBE cells was respectively 0.767±0.086 and 0.405±0.034 ( P ＜0.01).The expression levels of TIMP3 protein in the A549 cells of the experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4 were 0.416±0.023，0.732±0.019，0.430±0.020 and 0.803±0.025，respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2，between the experimental groups 3 and 4 ( all P＜0.05).The cell proliferation ability was increased in A549 cells after overexpressing miR-222 and silencing TIMP3 for 48 h，72 h and 96 h ( all P＜0.05).After 48 h，in the A549 cells，the number of cells through the basement membrane in the experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4 were 104±5，204±8，99±4 and 188±7，respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2，between the experimental groups 3 and 4 ( all P＜0.05).Conclusion The proliferation and invasion abilities of human non-small-cell lung cancer cells transfected by miR-222 are enhanced which may be related with miR-222 targeted-regulating TIMP3.

Key words:microRNA-222; lung neoplasm; non-small-cell lung cancer; matrix metalloproteinase inhibitor 3; cell proliferation;cell invasion

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多種基因的參與和多種因子的調(diào)控。miRNA是重要的調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)相關(guān)癌基因或抑癌基因，從而參與多種腫瘤的發(fā)生、進展過程［1，2］。目前研究者發(fā)現(xiàn)的miRNA已有上百種，其中miRNA-222是一個重要的miRNA分子。miRNA-222在多種腫瘤中表達增高，包括乳腺癌［3］、膀胱癌［4］、結(jié)腸癌［5］、膠質(zhì)母細胞瘤［6］以及胰腺癌［7］，提示miRNA-222可能是一個潛在的致癌因子。TIMP3在多種腫瘤中表達下調(diào)，并且與腫瘤細胞的增殖與侵襲相關(guān)［8，9］。目前對于miRNA-222與TIMP3在肺癌中表達情況及相關(guān)作用尚未明確，本研究觀察了miR-222基因轉(zhuǎn)染對人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲的影響。

1　材料與方法

1.1主要材料人支氣管上皮細胞16HBE和非小細胞肺癌A549細胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈; RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司(美國) ; MTT粉購自Sigma公司(美國) ; Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國) ; Transwell小室購自BD公司(美國) ; miR-222 mimics(用于過表達miR-222)、scramble(用于miRNA對照)、TIMP3-siRNA(用于沉默TIMP3)與si-control(用于沉默TIMP3對照)序列均由Exiqon公司設(shè)計合成; RNA抽提試劑盒購自Applied Biosystems公司; TIMP3和β-actin抗體購自Santa Cruz公司(美國)。

1.2 A549、16HBE細胞miR-222檢測采用qRTPCR。用RNA抽提試劑盒抽提16HBE和A549細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA保存于－80℃冰箱中備用。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括MiR-PCR primers ( 5 mmol/L) 0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，Taq DNA polymerase 5 U/μL) 0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為95℃3 min，95℃12 s，62℃35 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，所測定的miR-222的相對表達量采用2－ΔΔCt表示。

1.3 A549細胞miR-222轉(zhuǎn)染方法及分組消化A549細胞，吹打成單細胞懸液并收集離心。傾棄上清培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，制成1×105個細胞/mL的懸液，用250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋100 pmol miRNA 和siRNA，輕輕混勻，室溫下孵育5 min;用250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋5 μL的Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min，然后將上述兩種稀釋液輕輕混勻，室溫孵育15 min。分別將兩者混合液500 μL加入上述不含抗生素和血清的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。分別將miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA、si-control轉(zhuǎn)染A549細胞，設(shè)為實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組。

1.4 A549細胞TIMP3蛋白檢測采用Western blotting法。取四組A549細胞，48 h后抽提各組細胞總蛋白，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入DNMT3A抗體或βactin抗體，4℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。

1.5 miR-222基因轉(zhuǎn)染對A549細胞增殖的影響

采用MTT法。取四組A549細胞，將各組細胞接種于96孔板中，設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)至臨近飽和，加滅菌MTT液20 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h取出，加入DMSO 150 μL/孔，低速振蕩10 min，選擇波長570 nm，在酶標儀上測定各孔細胞在24、48、72和96 h的吸光值，并記錄。

1.6 miR-222基因轉(zhuǎn)染對A549細胞侵襲的影響

采用Transwell法。在Transwell小室中鋪加基質(zhì)膠稀釋液放置過夜成膜。次日取四組A549細胞100 μL稀釋液接種至小室的上腔，下腔加500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，取出，擦棄小室上層細胞，4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶祡染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

miR-222在A549、16HBE細胞的表達分別為0.767±0.086、0.405±0.034，兩者比較，P＜0.01。實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組A549細胞中TIMP3蛋白表達分別為0.416± 0.023、0.732±0.019、0.430±0.020與0.803 ±0.025，實驗1組與實驗2組比較，實驗3組與實驗4組比較，P均＜0.05。在A549細胞中miR-222基因轉(zhuǎn)染或沉默TIMP3 48、72、96 h后，細胞的增殖能力增強，詳見表1。實驗1組、實驗2組、實驗3組、實驗4組A549細胞48 h后穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)分別為( 104±5)、( 204±8)、( 99±4)、( 188±7)個，實驗1組與實驗2組比較，實驗3組與實驗4組比較，P均＜0.05。

表1　 miR-222基因轉(zhuǎn)染對A549細胞增殖的影響(±s)

表1　 miR-222基因轉(zhuǎn)染對A549細胞增殖的影響(±s)

注:實驗1組與實驗2組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;實驗3組與實驗4組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

組別細胞增殖24 h　48 h　72 h　96 h實驗1組　0.436±0.025　 0.590±0.047*　0.740±0.042#　0.852±0.065#實驗2組　0.419±0.010　 0.485±0.023　 0.569±0.036　 0.636±0.031實驗3組　0.423±0.021　 0.600±0.042*　0.746±0.038▲　0.843±0.024▲實驗4組　0.418±0.018　 0.501±0.021　 0.580±0.037　 0.645±0.027

3　討論

非小細胞肺癌包括腺癌和鱗狀細胞癌，是肺癌最常見的組織學(xué)類型，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其5年存活率低，約為13%［10］。miRNA是一類長度為18～24個核苷酸的非編碼、內(nèi)源性小RNA分子，通過靶向結(jié)合mRNA的3'非編碼區(qū)，使翻譯抑制或?qū)е耺RNA降解，進而調(diào)控靶基因表達量［1］。miRNA參與重要生物學(xué)進程的調(diào)控，包括細胞增殖、凋亡、分化、代謝等過程。目前，大量的研究者聚焦于腫瘤與表達失調(diào)的miRNAs之間關(guān)系的研究。研究［11，12］發(fā)現(xiàn)miRNA-222在多種腫瘤中有類似癌基因樣作用，通過抑制CDK抑制因子p27Kip1 和p57或上調(diào)EMT誘導(dǎo)基因ZEB2發(fā)揮致癌作用。miR-222在胰腺癌中表達上調(diào)，通過下調(diào)Ki67促進腫瘤細胞的增殖［4］。miR-222在乳腺癌中表達上調(diào)，通過靶向脂聯(lián)素受體1促進EMT轉(zhuǎn)化［13］。miR-222在卵巢癌和肝癌中表達上調(diào)，分別通過靶向其靶基因p27Kip1與p27促進腫瘤細胞的增殖［14，15］。由此可見，miR-222在腫瘤細胞中高表達，可能通過調(diào)控細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，外源高表達miR-222能明顯促進肺癌細胞的增殖與侵襲，提示miR-222在肺癌中具有潛在的促癌作用。

Gan等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在乳腺癌中表達上調(diào)，TIMP3是miR-222直接調(diào)控的靶基因，外源沉默乳腺癌細胞中miR-222的表達可通過上調(diào)TIMP3促進乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性。TIMP3是一種前凋亡蛋白，與多種腫瘤細胞的增殖與侵襲相關(guān)［8］。研究［8，9］顯示，TIMP3在子宮內(nèi)膜癌以及胃癌中表達下調(diào)，并且與患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中外源過表達miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達，而在肺癌細胞中沉默TIMP3后，肺癌細胞的增殖與侵襲能力也明顯增強，進一步提示TIMP3是miR-222下游的功能靶點，miR-222通過下調(diào)TIMP3的表達促進肺癌細胞的增殖與侵襲。

綜上所述，miR-222基因轉(zhuǎn)染的人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲能力增強，其可能與miR-222靶向調(diào)控TIMP3作用有關(guān)。miR-222可能是一個潛在的治療靶點，這為肺癌的防治提供了有用的實驗依據(jù)。

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收稿日期:( 2015-03-12)

通信作者簡介:羅衛(wèi)民( 1978-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向為食管癌、肺癌的診斷及治療。E-mail: luoweimin0803@ sina.com

作者簡介:第一羅湘玉( 1972-)，女，副主任護師，主要研究方向為食管癌、肺癌的診斷及治療。E-mail: Luoxiangyu2000@126.com

基金項目:湖北省教育廳科學(xué)研究計劃指導(dǎo)性項目( B2015477)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0014-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.005