付文舉，張德志，王國喜，劉玉林( 泰州市第二人民醫(yī)院，江蘇泰州5500;遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

磷酸化PKC-δ對地塞米松誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

付文舉1，張德志2，王國喜1，劉玉林1
( 1泰州市第二人民醫(yī)院，江蘇泰州225500;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

摘要:目的觀察磷酸化PKC-δ對地塞米松( Dex)誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響。方法取新生SD大鼠顱骨第3代成骨細(xì)胞，分為對照組、Dex組( 1×10－7mol/L Dex)、PMA預(yù)處理組( 1×10－7mol/L Dex + 100 nmol/L PMA)、Rottlerin預(yù)處理組( 1×10－7mol/L Dex +2 μmol/L Rottlerin)，培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡，采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及磷酸化PKC-δ。結(jié)果與對照組相比，Dex組細(xì)胞增殖活性低，細(xì)胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高，Bcl-2表達(dá)低( P均＜0.05)。與Dex組相比，PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低，細(xì)胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高，Bcl-2表達(dá)低( P均＜0.05)。與Dex組相比，Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高，細(xì)胞凋亡少，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)低，Bcl-2表達(dá)高( P均＜0.05)。結(jié)論磷酸化PKC-δ可促進(jìn)Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞:蛋白激酶C-δ;半胱氨酸蛋白3; B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白x; B細(xì)胞淋巴瘤2;成骨細(xì)胞;細(xì)胞調(diào)亡

Effect of phosphorylated PKC-δ on Dexamethasone-induced osteoblast apoptosis of rats

FU Wen-jyu1，ZHANG De-zhi，WANG Guo-xi，LIU Yu-lin
( Second People＇s Hospital of Taizhou，Taizhou 225500，China)

Abstract:Objective To observe the effect of phosphorylated protein kinase C-δ( PKC-δ) on Dexamethasone ( Dex) -induced osteoblast apoptosis of rats.Methods The osteoblasts of the third generation from newly born SD rats' calvaria were divided into four groups: the control group，Dex group ( 1×10－7mol/L Dex)，PMA preconditioning group ( 1× 10－7mol/L Dex +100 nmol/L PMA) and Rottlerin preconditioning group ( 1×10－7mol/L Dex + 2 μmol/L Rottlerin).The cells of each group were incubated for 24 h.Then，the cell proliferation activity was measured by MTT assay，the apoptosis was detected by AnnexinⅤ-FITC/propidium iodide ( PI) -flow cytometry ( FCM) and acridine oringe/ethidium bromide ( AO/EB) staining，and the expression of the apoptosis-related proteins ( Bcl-2，Bax and Caspase-3) and phosphorylated PKC-δ was detected by Western blotting.Results Compared with the control group，the proliferation activity was reduced，the apoptosis was increased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was increased，while the Bcl-2 expression was decreased in the Dex group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Compared with the Dex group，the cell proliferation activity was reduced，the apoptosis was increased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was increased，while the Bcl-2 expression was decreased in the PMA preconditioning group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Compared with the Dex group，the cell proliferation activity was obviously higher，the apoptosis was decreased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was decreased，while the Bcl-2 expression was increased in the Rottlerin preconditioning group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Conclusion The phosphorylated PKC-δ can promote the Dex-induced osteoblast apoptosis of rats.

Key words:protein kinase C-δ; caspase-3; B-cell lymphoma related protein x; B-cell lymphoma 2; osteoblasts; apoptosis

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死是股骨頭壞死的主要原因之一，其病理生理機制中涉及蛋白激酶C ( PKC)信號途徑的激活［1］。PKC-δ是PKC家族的重要成員，可參與多種細(xì)胞凋亡因子刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2～4］，但在成骨細(xì)胞凋亡方面的研究較少。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素中，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax一直備受關(guān)注。因此，本研究觀察了磷酸化PKC-δ對Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響，為明確Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑出生24 h內(nèi)SD大鼠10只，購自遼寧醫(yī)學(xué)院動物培養(yǎng)中心。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Heclone公司，吖啶橙、溴乙錠、Ⅰ型膠原酶、MTT購自Sigma公司，茜素紅為國產(chǎn)，PKC-δ選擇性抑制劑Rottlerin、PKC激活劑佛波酯( PMA)購自美國Calbiochem公司，抗磷酸化PKC-δ一抗購自北京博奧森試劑有限公司，Annexin V-FITC流式檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定取所有大鼠顱骨，采用酶消化法分離成骨細(xì)胞，按1×105/mL濃度接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，24 h后首次換液，以后每2 d換液1次，待細(xì)胞融合至80%左右時，進(jìn)行傳代，取第3代成骨細(xì)胞用于實驗。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)的方法鑒定。24 h內(nèi)細(xì)胞貼壁，形態(tài)上呈多形性，主要為長梭形，胞質(zhì)有突起，向外伸展; 1周后，細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列，多數(shù)呈鱗片狀，體較大，多偽足，胞質(zhì)豐富，胞核較大;繼續(xù)培養(yǎng)，可見局部多層生長，并有黑色鈣結(jié)節(jié)生成。

1.2.2成骨細(xì)胞凋亡模型建立取70%～80%融合的第3代成骨細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液，分為對照組(未做任何處理)、Dex組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10－7mol/L)、PMA預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10－7mol/L、PMA濃度為100 nmol/L)、Rottlerin預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1× 10－7mol/L、Rottlerin濃度為2 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3成骨細(xì)胞增殖活性檢測采用MTT法。取上述四組細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔板，每組8復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清，加入培養(yǎng)液稀釋的MTT( 1 mg/mL)，每孔10 μL，置培養(yǎng)箱中4 h;棄上清，加入等體積二甲亞砜，振蕩10 min，結(jié)晶溶解，呈紫色溶液; BIO-RAD680型酶標(biāo)儀490 nm波長測吸光度值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4成骨細(xì)胞凋亡檢測采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測。參照Annexin V-FITC流式檢測試劑盒說明收集上述四組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3次，取平均值。取上述四組細(xì)胞，PBS沖洗2次，0.1 g/L的AO/EB混合液染色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒，正常細(xì)胞呈綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察200倍視野下，隨機計數(shù)100個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞所占的比例。細(xì)胞凋亡率( %) = (凋亡細(xì)胞/計數(shù)細(xì)胞總個數(shù))× 100%。

1.2.5各組成骨細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ檢測采用Western blotting法。取上述四組細(xì)胞，以添加磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，獲取胞質(zhì)蛋白。等量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，與抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體及抗磷酸化PKC抗體( 1∶400稀釋) 4℃孵育過夜，與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，用ECL顯影在柯達(dá)膠片上。同一膜用洗脫液洗脫，檢測β-actin表達(dá)( Abcam一抗1∶3 000稀釋)作為內(nèi)對照。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖活性比較對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞吸光度值分別為0.437±0.013、0.379±0.012、0.369±0.013、0.410± 0.010，Dex組與其他三組比較，P均＜0.05。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為3.5%±0.46%，19.0%± 0.54%、26.7%±0.69%、10.5%±0.35%，Dex組與其他三組比較，P均＜0.05。

AO/EB雙熒光檢測結(jié)果顯示，對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為2.9%±0.45%、20.6%±0.50%、33.4%± 0.55%、14.0%±0.30%，Dex組與其他三組比較，P均＜0.05。

2.3各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較結(jié)果見表1。

表1　各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

表1　各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與Dex組比較，△P＜0.05。

組別　Caspase-3( 17 kDa)　 Caspase-3( 28 kDa)　Bax　Bcl-2　　磷酸化PKC-δ對照組　0.349 75±0.015 01　 0.323 91±0.013 72　 0.246 63±0.015 35　 0.653 42±0.022 06　 0.223 65±0.015 24 Dex組　0.610 23±0.038 94*　0.52 340±0.035 79*　0.374 51±0.035 03*　0.402 65±0.032 01*　0.613 25±0.038 47*PMA預(yù)處理組　0.704 21±0.043 25＊△0.715 39±0.038 97＊△0.539 78±0.040 87＊△0.294 62±0.030 79＊△0.734 25±0.041 98＊△Rottlerin預(yù)處理組　0.501 34±0.031 52＊△0.453 61±0.030 87＊△0.301 75±0.031 64＊△0.453 42±0.029 01＊△0.429 87±0.030 27＊△

3　討論

Weinstein等［5］最早提出糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少。隨后的臨床研究及動物實驗研究［6，7］發(fā)現(xiàn)，激素性骨壞死所致股骨頭中可見大量凋亡的骨細(xì)胞。本實驗中我們用Dex成功誘導(dǎo)建立成骨細(xì)胞凋亡模型。另外，我們的前期實驗研究［1］證明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC通路相關(guān)。

PKC是一類富含絲/蘇氨基酸的激酶，在機體組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，目前已發(fā)現(xiàn)12種亞型，作為細(xì)胞信號的重要成分對機體多種細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面起重要作用。在不同細(xì)胞中PKC各亞型作用各異，且受刺激因子不同和條件的影響［8，9］。PKC-δ可通過多種信號通路及相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10，11］。Rottlerin為PKC-δ的特異性抑制劑，PMA為PKC激活劑。本實驗中MTT法檢測結(jié)果顯示，Dex組細(xì)胞增殖活性低于對照組，Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高于Dex組，PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低于Dex組。流式細(xì)胞儀檢測及AO/EB雙熒光染色結(jié)果均表明，與對照組比較，Dex組細(xì)胞凋亡明顯增加，且PMA預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡增加，Rottlerin預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡減少?？梢?，Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC-δ的磷酸化有關(guān)。Bcl-2的同系物Mcl-1與PKC-δ參與的HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)［12］。本實驗檢測結(jié)果顯示磷酸化PKC-δ表達(dá)的變化與促凋亡蛋白Caspase-3 和Bax一致，與凋亡保護(hù)性蛋白Bcl-2相反。由此，進(jìn)一步確認(rèn)PKC-δ的高表達(dá)與細(xì)胞的凋亡相關(guān)，推測PKC-δ可能是通過促使Caspase-3、Bax的活化及抑制Bcl-2的表達(dá)水平，從而影響Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡。但其具體的作用途徑尚待進(jìn)一步研究。

PKC-δ作用底物種類眾多，該信號傳導(dǎo)通路復(fù)雜，目前仍不斷有新的PKC-δ作用途徑提出，其最終的作用機制以及調(diào)解因子目前仍然沒有得到確定。本實驗在離體細(xì)胞水平上證實了PKC-δ是Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡中PKC途徑的重要一環(huán)，Rottlerin可通過抑制PKC-δ的表達(dá)減少細(xì)胞的凋亡，但PKC-δ究竟是通過介導(dǎo)何種信號通路來參與Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡還有待進(jìn)一步研究。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-05-02)

作者簡介:第一付文舉( 1986-)，男，住院醫(yī)師，主要研究方向為骨壞死的病因與機制。E-mail: fuwenju2011@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( 81041063)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0020-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R681

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.007