周昌鉆+季政++孟立平++郭航遠(yuǎn)

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞自噬；炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R543.3；R363.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-816X（2015）06-0482-04

doi.10.3969/j.issn.1009-816x.2015.06.16

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種存在于真核細(xì)胞中并與核膜、高爾基體、細(xì)胞膜相互連續(xù)，參與分泌蛋白、膜蛋白折疊及Ca2+水平調(diào)節(jié)的復(fù)雜膜性結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮折疊功能需分子伴侶參與，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78kDa （glucoseregulated protein 78kDa，GRP78）、鈣連蛋白、鈣網(wǎng)蛋白幫助新生多肽正確折疊，糖基化修飾酶類（寡糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶）進(jìn)行糖化修飾。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化還原狀態(tài)和高鈣環(huán)境也是其發(fā)揮功能所必須的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化敏感，可受高糖、缺氧、藥物、血流剪切力等因素干擾，影響其蛋白質(zhì)折疊功能，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS主要激活三條信號(hào)通路：未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前對(duì)ERS信號(hào)通路的研究主要集中在UPR信號(hào)通路。

研究顯示ERS參與了心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、腎臟疾病、肝臟疾病等的發(fā)生與發(fā)展。ERS作為一種重要機(jī)制參與多種疾病的調(diào)節(jié)，但其具體作用方式仍不明確。本文重點(diǎn)就內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與動(dòng)脈粥樣硬化這一病理生理過程的調(diào)節(jié)機(jī)制做一論述。

1 ERS

ERS刺激細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性的UPR反應(yīng)。由輕微的、短暫的環(huán)境變化引起的ERS可被UPR反應(yīng)迅速糾正，避免機(jī)體的損傷。而明顯的病理環(huán)境下引起的ERS常持續(xù)而強(qiáng)烈，超過UPR的糾正能力，進(jìn)一步激活UPR下游的損傷性信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。UPR信號(hào)通路包括蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER kinase，PERK）信號(hào)通路、肌醇需求酶1 （inositol-requiting enzyme 1，IREl）信號(hào)通路、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）信號(hào)通路。三種ERS感受器同屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，一般情況下與GRP78結(jié)合并處于無活性狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)控的積聚可誘導(dǎo)GRP78與三者解離，并促使三種膜蛋白磷酸化激活，啟動(dòng)下游信號(hào)通路。信號(hào)通路從促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、抑制蛋白質(zhì)翻譯、降解錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)三方面減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷。研究發(fā)現(xiàn)，其他改變應(yīng)激感受器分子構(gòu)象的因素，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔ATP、Ca2+及氧化還原水平的改變或者應(yīng)激感受協(xié)同因子Erdj5，都可通過影響其與GRP78的連接，誘發(fā)ERS。

1.1 PERK-CHOP信號(hào)通路：PERK腔內(nèi)端與GRP78解離后暴露磷酸化位點(diǎn)并被激活。激活的PERK受體可磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2（eukaryotic trans-lation initiation factor 2，eIF2）a亞基，抑制其征集Met-tRNA和40S核糖體亞單位的能力，最終影響大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯。但是，UPR信號(hào)通路中的多種信號(hào)通路蛋白，如ATF4卻可逃避這種機(jī)制的影響，在細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)翻譯表達(dá)。ATF4可作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于UPR相關(guān)基因啟動(dòng)子的ERS反應(yīng)元件（ER stress response element，ERSE），上調(diào)CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer-binding protein ho-mologous protein， CHOP）及生長(zhǎng)抑制與DNA損傷誘導(dǎo)基因34 （growth arrest and DNA-damage-inducible gene34，GADD34）的表達(dá)。GADD34可去磷酸化eIF2a-P，恢復(fù)eIF2a正確活性，防止蛋白表達(dá)抑制過度導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。CHOP與其同源蛋白結(jié)成穩(wěn)定的二聚體，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，一方面抑制抑凋亡基因Bcl-2、Bnip3表達(dá)，另一方面使凋亡基因，如GADD34、Bim上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CHOP除受PERK調(diào)節(jié)外，也受到IRE1和ATF6信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，但不作為主要調(diào)節(jié)機(jī)制。

1.2 IREl-XBP1信號(hào)通路：IRE1與GRP78解離后，在空間上相互接近并發(fā)生自體磷酸化。P-IREla具有核酸內(nèi)切酶活性，從X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein-l，XBP-1） mRNA中特異性剪切出26個(gè)堿基的內(nèi)含子，改變XBP-1 mRNA開放閱讀框，最終翻譯出有活性的XBP1蛋白。XBP1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于ERSE，既可上調(diào)ERS相關(guān)降解（endoplasmic reticu-lum-associated degradation，ERAD）的相關(guān)蛋白如GRP78的表達(dá)，也可影響脂質(zhì)代謝進(jìn)程。此外，研究發(fā)現(xiàn)IRE1可根據(jù)mRNA編碼序列，選擇性降解引起ERS蛋白的mRNA，在翻譯水平減少蛋白質(zhì)產(chǎn)生，緩解ERS。

1.3 ATF6信號(hào)通路：ATF6作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅱ型跨膜蛋白，在ERS中轉(zhuǎn)移至高爾基體，隨即被位點(diǎn)蛋白酶1（site protease 1，SPl）和SP2裂解，產(chǎn)生bZIP轉(zhuǎn)錄因子ATF6（P50）。隨后該片段進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于ERSE，激活CHOP. XBP1等ERAD相關(guān)蛋白的表達(dá)。經(jīng)典的UPR反應(yīng)可激活三條信號(hào)通路，但研究發(fā)現(xiàn)UPR信號(hào)通路也具有組織特異性，如ERS誘導(dǎo)物誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化時(shí)，只發(fā)現(xiàn)IRE1和ATF6通路激活。

2 ERS參與動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制

ERS存在于動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)時(shí)期，且長(zhǎng)期的ERS被視為促動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

2.1 ERS與細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣斑塊的破裂密切相關(guān)。檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都存在明顯的細(xì)胞凋亡。在動(dòng)脈粥樣硬化后期，巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞凋亡釋放大量脂質(zhì)、溶酶體酶和自由基，并增加斑塊壞死核心的體積，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，進(jìn)一步加重局部炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡破壞了血管內(nèi)皮完整性，致內(nèi)皮下的膠原暴露，引起血小板聚焦和附壁血栓的形成，促進(jìn)oxLDL滲入粥樣斑塊，增加粥樣斑塊破裂的可能。此外，纖維帽部分的血管平滑肌細(xì)胞凋亡可影響膠原纖維分泌，致使粥樣斑塊的帽狀結(jié)構(gòu)更加薄弱，促使斑塊向不穩(wěn)定斑塊發(fā)展。endprint

細(xì)胞凋亡由兩條相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)瀑布調(diào)控：內(nèi)在的線粒體途徑以及外在的死亡受體（death receptor，DR）途徑。ERS對(duì)兩條信號(hào)通路都存在調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，短暫的ERS可激活I(lǐng)REla的核酸酶活性，介導(dǎo)IREla依賴的衰退（IREla-dependent decay，RIDD），通過水解DR5的mRNA，抑制DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡持續(xù)的應(yīng)激則導(dǎo)致IREla核酸酶活性逐漸下降，DR5 mRNA轉(zhuǎn)錄與降解間的平衡向促凋亡側(cè)傾斜，最終誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。此外，ERS還可通過CHOP蛋白影響細(xì)胞調(diào)亡。ERS激活的UPR三條信號(hào)通路（PERK-eIF2a，IREl-XBP1和ATF6）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CHOP，上調(diào)促凋亡分子GADD34、Bax、Bak、Bim，下調(diào)抑凋亡分子Bc12。CHOP蛋白可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣釋放通道，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。若ERS持續(xù)狀態(tài)未得到改善，則進(jìn)入最后的細(xì)胞凋亡程序。ERS在細(xì)胞調(diào)亡中的作用隨著研究的深入已逐漸清晰，控制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的ERS可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)新的策略。

2.2 ERS與細(xì)胞自噬：細(xì)胞自噬是細(xì)胞在某些生理或病理因素刺激下，損傷的細(xì)胞器和無功能蛋白被來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的雙層膜性小泡包裹，后與溶酶體融合，并被降解、回收利用的一種病理生理過程。Ox-LDL可抑制血管皮內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，破壞血管內(nèi)膜完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，用脂聯(lián)素促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞自噬可穩(wěn)定斑塊，抑制斑塊進(jìn)展。此外，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞自噬可有效地抑制平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。ERS可激活細(xì)胞自噬一溶酶體系統(tǒng)參與損傷細(xì)胞器和無功能蛋白的降解，并被視為Ⅱ型ERAD，可作為ERAD的補(bǔ)充和替代。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，多種自噬蛋白，如Beclins、自噬蛋白5（autophagy protein 5，ATG5）等表達(dá)上調(diào)。ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可通過稱為“噬脂”的過程，水解細(xì)胞吞噬的脂肪滴，介導(dǎo)膽固醇向胞外的載脂蛋白AI轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇的代謝和外流，減輕泡沫細(xì)胞脂質(zhì)負(fù)荷。若抑制細(xì)胞自噬，如敲除ATG5，則可檢測(cè)到主動(dòng)脈全段泡沫細(xì)胞數(shù)量和斑塊面積的顯著增加。

ERS既能增強(qiáng)細(xì)胞自噬也可抑制細(xì)胞自噬。研究發(fā)現(xiàn)，UPR下游中的ATF4、CHOP，可誘導(dǎo)多種ATG家族成員的表達(dá)；IREa信號(hào)通路可促進(jìn)自噬小泡的形成。若通過敲除ATG16L1基因抑制細(xì)胞自噬，則UPR相關(guān)分子如GRP78、eIF2a-P、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、IRE1表達(dá)水平顯著升高?？梢奅RS與細(xì)胞自噬存在相互作用的關(guān)系。此外，ERO的下游通路也存在抑制細(xì)胞自噬發(fā)生的機(jī)制。在多種細(xì)胞中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，若敲除ERAD過程的腳手架蛋白一同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白（homocysteine-inducible ER stress protein， Herp），可檢測(cè)到細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclinl和ATG5水平的顯著升高，以及細(xì)胞在應(yīng)激下更強(qiáng)的存活能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也提示Herp敲除能增加主動(dòng)脈血管細(xì)胞自噬水平，顯著延緩斑塊進(jìn)展。ERS對(duì)細(xì)胞自噬的雙重作用的生理意義，如何利用細(xì)胞自噬保護(hù)性作用的同時(shí)選擇性的抑制ERS下游中抑細(xì)胞自噬信號(hào)通路，可能在動(dòng)脈粥樣硬化治療方面具有重要的價(jià)值。

2.3 ERS和炎癥反應(yīng).動(dòng)脈粥樣硬化目前被普遍接受是一種慢性炎癥反應(yīng)過程。動(dòng)脈斑塊區(qū)域可檢測(cè)到多種趨化因子高表達(dá)，并且這些趨化因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)一步聚集，加劇炎癥反應(yīng)，影響斑塊穩(wěn)定性。ERS在循環(huán)系統(tǒng)和非循環(huán)系統(tǒng)疾病中都與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Wang YI等觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞的ERS水平與血管細(xì)胞粘附因子呈正相關(guān)。Shinozaki等發(fā)現(xiàn)，作為UPR腳手架蛋白的Herp，可能作為炎癥誘導(dǎo)因子參與粥樣斑塊的形成，誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子1（mono-cyte chemotactic protein 1，MCPl）、TNF-a、IL-6在斑塊區(qū)域血管的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ERS下游分子ATF4在內(nèi)皮細(xì)胞中可誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，并磷酸化激活炎癥因子KB（nuclear factor-KB，NF-KB）和JNK[18]。此外，PERK通路中的P-eIF2a，可抑制包括NF-KB抑制物inhibitor-KB （kB）在內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯，從而增加NF-jcB的活性[19]。Nakajima等用亞麻酶細(xì)胞毒素模擬ERS中GRP78解離過程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞通過Akt-ATF6-NF-KB信號(hào)通路激活炎癥反應(yīng)瀑布。近期研究發(fā)現(xiàn)，激活的IREa信號(hào)通路可征集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2），并形成復(fù)合體，一方面激活下游分子NF-KB，另一方面啟動(dòng)IKB的磷酸化降解途徑。同樣，已經(jīng)有越來越多的研究證實(shí)通過藥物干預(yù)ERS或者抑制某些UPR信號(hào)，可有效抑制血管細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

2.4 ERS與線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間存在天然的聯(lián)系，線粒體膜表面有約5%～20%的面積與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在連接，此部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜稱為線粒體連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria-associated ER mem-branes，MAM）。MAM作為多種信號(hào)通路傳遞的平臺(tái)，對(duì)線粒體融合、線粒體鈣負(fù)荷、線粒體呼吸等生理活動(dòng)都有重要調(diào)節(jié)作用。MAM結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定由兩者膜上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體融合蛋白二聚體和BiP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜sigma-1受體間的連接維持。這些MAM位點(diǎn)有相當(dāng)高濃度的Ca2+，并通過線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體，參與Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間的快速流動(dòng)。

目前，實(shí)驗(yàn)中常用毒胡蘿卜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶，模擬ERS狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平失調(diào)，構(gòu)建細(xì)胞ERS模型。細(xì)胞ERS時(shí)常伴有Ca2+通道分子構(gòu)象改變和1，4，5一三磷酸肌醇受體激活，隨后釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+入胞漿。升高的胞漿Ca2+通過線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入線粒體。短期的線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+超載，維持其正常功能，而長(zhǎng)期轉(zhuǎn)運(yùn)則會(huì)引起線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，干擾線粒體能量代謝。導(dǎo)致能量障礙，進(jìn)一步抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶攝取胞漿Ca2+能力，加重細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，激活線粒體凋亡通路。Munoz等研究發(fā)現(xiàn)PERK在MAMs的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能的維持具有重要作用，提示ERS時(shí)PERK表達(dá)的上調(diào)可能加速了線粒體Ca2+超載的進(jìn)程。ApoE-/-鼠體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定，也發(fā)現(xiàn)可保護(hù)血管內(nèi)膜的完整性，并能抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的惡化。

3 小結(jié)

ERS在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用重要且廣泛，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化這種慢性疾病。動(dòng)脈粥樣硬化的轉(zhuǎn)歸由保護(hù)性反應(yīng)（細(xì)胞自噬）和損傷性反應(yīng)（細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、能量代謝紊亂）共同決定。ERS可誘導(dǎo)細(xì)胞一系列信號(hào)通路的激活，并決定細(xì)胞不同的命運(yùn)。短暫的ERS反應(yīng)可被UPR迅速糾正，并短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的抵抗能力，而持久或劇烈的ERS無法被細(xì)胞自身調(diào)節(jié)機(jī)制糾正，進(jìn)一步加劇細(xì)胞功能紊亂，最終引導(dǎo)細(xì)胞走向死亡。ERS并不總扮演損傷性角色在心肌缺血前誘導(dǎo)ERS可增加心肌細(xì)胞在缺血中的存活率；在動(dòng)脈粥樣硬化早期，ERS誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞凋亡可抑制斑塊面積擴(kuò)大。ERS對(duì)細(xì)胞功能影響較為廣泛，如何通過精確的信號(hào)通路抑制或誘導(dǎo)ERS，以及調(diào)節(jié)下游保護(hù)性和損傷性反應(yīng)間的平衡已成為治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的重要研究熱點(diǎn)。但是目前我們對(duì)ERS機(jī)制的了解還不完善，仍有待于對(duì)ERS信號(hào)通路更深層次的研究。endprint