郗艷麗，鄭曉娟，魏振奇，劉　敏，葛紅娟，宋春梅

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林　132013)

·論著·

齊墩果酸對(duì)小鼠急性肝臟氧化損傷治療作用研究

郗艷麗，鄭曉娟，魏振奇，劉敏，葛紅娟，宋春梅*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林132013)

摘要：目的建立肝臟急性氧化損傷模型，觀察齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟氧化損傷的治療作用。方法3 mL/kg四氯化碳(CCl4)腹腔注射，24 h后給予齊墩果酸灌胃，干預(yù)2 d后處死小鼠。檢測(cè)肝臟臟器系數(shù)、病理改變、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果齊墩果酸未拮抗CCl4引起的SOD含量降低以及MDA含量升高(P>0.05)，也未能減輕小鼠肝組織的損傷程度。結(jié)論CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝臟氧化損傷以后，再給予齊墩果酸治療，效果不佳。

關(guān)鍵詞：齊墩果酸；氧化損傷；治療作用

文章編號(hào)：1673-2995(2015)02-0081-03

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：識(shí)碼： A

Abstract:ObjectiveTo establish an acute liver oxidative damage model and investigate the therapeutical effects of oleanolic acid on mouse modell. MethodsThe mice were injected with carbon tetrachloride at the dose of 3 mL/kg.After 24 hours,they were gavagedwith oleanolic acid once every day. After Two days,the mice were sacrificed to measure their liver indexes,pathological changes,superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in liver. ResultsOleanolic acid treatment exhibited no significant inhibition effect on the decrease in SOD activity and increase in MDA content(P>0.05),and failed to reduce the extent of damage in liver. ConclusionIt is anineffective treatment with oleanolic acid for CCl4-induced acute liver oxidative damage in mice.

基金項(xiàng)目：吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目.

作者簡(jiǎn)介：郗艷麗(1981-)，女(漢族)，講師,博士.

通訊作者：宋春梅(1964-)，女(漢族)，教授，碩士.

收稿日期：( 2014-11-04)

Therapeutical effects of oleanolic acid on acute liver oxidative damage in mice

XI Yanli,ZHENG Xiaojuan,WEI Zhenqi,LIU Min,GE Hongjuan,SONG Chunmei*(School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Key words: oeanolic acid;oxidative damage;terapeutical effects

急性肝損傷是各種原因引起的肝功能異常，嚴(yán)重的肝損傷會(huì)導(dǎo)致肝功能衰竭。引起肝急性損傷的原因很多，主要有用藥不當(dāng)、食品添加劑使用不當(dāng)、乙醇攝入過多、病毒感染等。氧化應(yīng)激是誘發(fā)肝損傷的主要原因之一。有效的預(yù)防和治療氧化損傷的藥物，可以避免患者發(fā)生肝臟衰竭，保護(hù)肝臟，甚至可以幫助患者迅速恢復(fù)肝臟功能，預(yù)防后遺癥。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)為五環(huán)三萜類化合物，主要來源于木犀科植物齊墩果的葉[1]。女貞子的果實(shí)也含有豐富的齊墩果酸[2]。目前已經(jīng)證實(shí)，齊墩果酸有抗氧化損傷的作用[3-5]。本研究采用四氯化碳(CCl4)制備肝急性氧化損傷模型，進(jìn)一步探討齊墩果酸對(duì)肝急性氧化損傷的治療作用及相關(guān)機(jī)理。

1材料與方法

1.1　試劑與儀器

齊墩果酸來源于西安文竹生物科技有限公司(HPLC≥98%)，臨用時(shí)稱取3 g齊墩果酸溶解于10 mL豆油中，置37 ℃水浴超生30 min，制成濃度為300 mg/mL的齊墩果酸豆油混懸液。CCl4、鄰苯三酚、鹽酸、硫代巴比妥酸、三氯醋酸均購(gòu)于天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。三氯醋酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液的配置：稱取TCA 15 g,TBA 0.375 g，2.5 mol/mL HCl 10 mL加蒸餾水至100 mL，在50 ℃左右的水浴中溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

TDZ5-WS離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，BS224S電子天平(北京賽多利斯)，722型分光光度計(jì)(中國(guó)廈門分析儀器廠)，DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，尼康正置顯微鏡(NIU)。

1.2　動(dòng)物分組及給藥方法

健康雄性SPF級(jí)ICR小鼠30只，4~5周齡，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004]。動(dòng)物采購(gòu)后，置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周，給予充足的食物和水。

隨機(jī)分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為對(duì)照組、染毒組、齊墩果酸治療組，每組動(dòng)物數(shù)為10只。對(duì)照組先給予3 mL/kg生理鹽水腹腔注射一次，24 h后給予豆油灌胃，1次/d，共干預(yù)2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。染毒組給予CCl4原液皮下注射一次，給予劑量為3 mL/kg，24 h后給予豆油灌胃，1次/d，共干預(yù)2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。齊墩果酸治療組先皮下注射3 mL/kg CCl4原液，24 h后給予齊墩果酸灌胃,1次/d，共干預(yù)2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。給水，禁食24 h,頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟備用。

1.3　肝臟臟器系數(shù)

準(zhǔn)確稱取肝臟濕重，按照公式計(jì)算肝臟的臟器系數(shù)：肝臟濕重(g)/體重(g)×100%=臟器系數(shù)。

1.4　肝組織病理學(xué)檢測(cè)

切取肝臟左葉置于10%甲醛固定液中，固定24 h后進(jìn)行常規(guī)的HE染色。

1.5　肝組織SOD含量的檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取肝組織0.5 g，加9倍生理鹽水，制成10%勻漿，2 500 rpm，離心10 min，取上清，鄰苯三酚法測(cè)定組織勻漿中的SOD含量。

1.6　肝組織MDA含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取肝組織0.5 g，加入9倍體積的150 mmol/L KCl溶液，制成10%勻漿，2 500 rpm，離心10 min，取上清，置于4℃冰箱中待測(cè)。取2支試管,樣品管加1 mL勻漿液,2 mL TCA-TBA-HCl;空白管加1 mL KCl,2 mL TCA-TBA-HCl,混勻后，加塞，置于沸水浴中煮沸15 min，取出后立即冷卻至室溫。經(jīng)4 000 rpm離心10 min，取上清于535 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定，以空白管調(diào)零。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL2007進(jìn)行處理分析。

2結(jié)果

2.1　齊墩果酸對(duì)急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟臟器系數(shù)

由圖1可知，染毒組的肝臟臟器系數(shù)明顯高于對(duì)照組，經(jīng)t檢驗(yàn)其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明CCl4對(duì)小鼠的肝臟有毒性作用。齊墩果酸治療組的肝臟臟器系數(shù)高于對(duì)照組，經(jīng)t檢驗(yàn)其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，治療組的肝臟臟器系數(shù)也明顯高于染毒組，經(jīng)t檢驗(yàn)其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果表明齊墩果酸對(duì)CCl4所致的小鼠急性毒性作用的治療作用不明顯，在CCl4引起急性損傷后給予齊墩果酸進(jìn)行治療，達(dá)不到理想的治療效果。相反，可能會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重。

(與對(duì)照組比較，*P<0.05)

2.2　齊墩果酸對(duì)急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟病理改變

從圖2可見，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝血竇清晰可見，未見淤血或擴(kuò)張。染毒組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色異常，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間界限不清。齊墩果酸治療組可見肝細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)濃縮，有空泡變性。

A:對(duì)照組；B:染毒組；C:OA治療組

2.3　齊墩果酸對(duì)急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟SOD含量的影響

小鼠肝臟SOD含量檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖3)，染毒組肝臟SOD的含量與對(duì)照組相比有降低的趨勢(shì)，經(jīng)t檢驗(yàn)分析其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，齊墩果酸治療組肝臟SOD含量與對(duì)照組相比也有降低的趨勢(shì)，經(jīng)t檢驗(yàn)分析其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。齊墩果酸治療組肝臟SOD含量與染毒組比較無明顯差異(P>0.05)。CCl4引起肝臟急性氧化損傷之后，再一次大劑量給予齊墩果酸治療，無法在短時(shí)間快速地清除損傷。

2.4　齊墩果酸對(duì)急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟MDA含量影響

小鼠肝臟MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明(見圖4)，與對(duì)照組相比，染毒組和齊墩果酸治療組小鼠肝臟MDA含量都明顯增加。齊墩果酸治療組MDA含量增加的更加明顯，且染毒組與對(duì)照組MDA含量比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，齊墩果酸組與對(duì)照組比較，其差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是齊墩果酸治療組與染毒組MDA含量比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果表明齊墩果酸對(duì)CCl4導(dǎo)致的急性肝臟氧化損傷的治療作用不明顯，或者根本沒有治療作用。

(與對(duì)照組比較，*P<0.05)

圖 3OA對(duì)急性肝臟氧化圖 4OA對(duì)急性肝臟氧化

SOD損傷小鼠肝臟損傷小鼠肝臟MDA

含量的影響 含量的影響

3討論

CCl4經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P-450催化發(fā)生一電子還原，脫鹵生成三氯甲烷自由基(·CCl3)，·CCl3作用于生物膜，引起生物膜不飽和脂肪酸過氧化，改變了生物膜的流動(dòng)性和通透性，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，破壞細(xì)胞骨架，引起肝細(xì)胞損傷和壞死。本研究利用CCl4一次大劑量給予的方法制備小鼠急性肝臟氧化損傷模型，經(jīng)肝臟臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組肝臟發(fā)生水腫變性。SOD是自由基清除劑，MDA是脂質(zhì)過氧化損傷的重要標(biāo)志。SOD水平降低、MDA含量水平升高表明機(jī)體受到自由基的侵害，出現(xiàn)了氧化損傷。本研究通過對(duì)SOD及MDA含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染毒組肝臟已經(jīng)受到了氧自由基的損傷。上述結(jié)果表明，本研究利用CCl4誘導(dǎo)急性肝臟氧化損傷小鼠模型造模成功。

齊墩果酸有抗氧化、清除自由基的功效，對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。有研究表明，提前給予齊墩果酸一次，可以保護(hù)CCl4導(dǎo)致大鼠的肝臟氧化損傷[6]。CCl4與齊墩果酸的不同給藥順序，可能會(huì)影響其干預(yù)效果。本課題組已經(jīng)證實(shí)，損傷之前給予齊墩果酸，可以起到保護(hù)小鼠肝臟、清除自由基的作用[7]。本研究在CCl4腹腔注射24 h以后，立即給予受試小鼠齊墩果酸灌胃，觀察其對(duì)CCl4引起肝臟損傷的治療效果。齊墩果酸治療組的檢測(cè)結(jié)果表明，造模成功后再給予齊墩果酸灌胃，無法達(dá)到預(yù)期的治療效果，對(duì)肝臟沒起到保護(hù)作用。SOD和MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明，齊墩果酸治療組與染毒組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。這表明齊墩果酸對(duì)CCl4導(dǎo)致的氧化損傷雖然沒起到治療作用，但也沒造成進(jìn)一步、更嚴(yán)重的損傷。

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