王宇祥，李 超，翟桂影，龐永佳，李 瑞，孫宇航，杜智恒

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是一類(lèi)配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。PPAR 包括PPARα、PPARβ和PPARγ 3 種表型，其中以PPARγ的研究最為深入[1]。PPARγ 主要在脂肪組織，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞中表達(dá)。PPARγ可以調(diào)節(jié)參與能量?jī)?chǔ)存和分解相關(guān)基因的表達(dá)[2]，并在脂肪細(xì)胞分化、脂肪生成、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、血管生成和動(dòng)脈粥樣硬化以及葡萄糖利用的調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用[3]。最近，PPARγ被發(fā)現(xiàn)在免疫炎癥調(diào)控中發(fā)揮重要作用。PPARγ可以通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞、減少自身抗體的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的功能及抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)來(lái)緩解自身免疫性疾病對(duì)機(jī)體的損害[4]；PPARγ 還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條炎癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等的基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[5-6]；此外，激活PPARγ還有利于誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞麻痹[7-8]。可見(jiàn)開(kāi)展PPARγ的功能研究對(duì)于預(yù)防和治療炎癥相關(guān)疾病具有重要的意義。

在研究基因功能的過(guò)程中，往往需要下調(diào)或抑制基因的表達(dá)，并觀察由此引起的細(xì)胞或組織表型的變化，從而推測(cè)其影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的可能作用[9]。T0070907 是一種新型合成的PPARγ基因抑制劑，化學(xué)式為C12H8CIN3O3。眾多研究表明，T0070907 是有效的PPARγ拮抗劑，對(duì)小鼠PPARγ基因具有較強(qiáng)的親和力和較高的選擇性，可以通過(guò)影響PPARγ基因的配體結(jié)合域第12 螺旋的構(gòu)象，調(diào)節(jié)PPARγ與共激活因子的相互作用而抑制PPARγ的活化[10-11]。其對(duì)PPARγ基因的偏好超過(guò)對(duì)PPARα基因和PPARβ基因的偏好，T0070907 對(duì)PPARγ活性的抑制作用已在小鼠胰腺細(xì)胞的報(bào)告基因和功能檢測(cè)中得到證實(shí)[12]，目前已成為研究PPARγ基因功能的主要工具。然而，本實(shí)驗(yàn)室在前期針對(duì)雞PPARγ基因的功能研究中偶然發(fā)現(xiàn)，T0070907 非但不能抑制雞PPARγ的活性，反而對(duì)該基因的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用。為驗(yàn)證這一現(xiàn)象的真實(shí)性，本研究利用熒光定量PCR、western blot 和報(bào)告基因技術(shù)，分別從mRNA 表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平及蛋白活性等方面檢測(cè)了抑制劑T0070907 對(duì)DF-1 細(xì)胞中雞PPARγ基因兩種亞型[13]表達(dá)的影響。以期為選擇合適的PPARγ抑制劑，開(kāi)展該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 T0070907 購(gòu)自MCE（Med Chem Express）公 司；TRIzol 購(gòu) 自Invitrogen 公 司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購(gòu)自Roche 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶和羅格列酮（Rosi）購(gòu) 自Gibco 公 司；Lipofectamine?2000 購(gòu) 自Invitrogen 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega 公司；RIPA 緩沖液、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、鼠源β-actin 抗體均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠源HA 抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 載體與細(xì)胞 PPARγ真核表達(dá)質(zhì)粒、過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（Peroxisome proliferator response element，PPRE）報(bào)告基因質(zhì)粒、報(bào)告基因活性對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK、DF-l 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。PPARγ真核表達(dá)質(zhì)粒、PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建方法簡(jiǎn)述如下：根據(jù)雞PPARγ基因序列分別設(shè)計(jì)引物（序列見(jiàn)表1），擴(kuò)增雞PPARγ1、PPARγ2 基因全長(zhǎng)編碼區(qū)；以雞脂肪組織cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后與pCMV-HA 載體連接，構(gòu)建成pCMV-HA-PPARγ1、pCMV-HA-PPARγ2 真 核 表 達(dá) 質(zhì)粒。根據(jù)PPRE（AGGTCAAAGGTCA）和pRL-TK 質(zhì)粒（Promega 公司）的相關(guān)序列，人工合成一段同時(shí)包含3 個(gè)PPRE 拷貝和TK 啟動(dòng)子的DNA 片段，使PPRE 序列位于TK 啟動(dòng)子的上游，并在DNA 片段5'和3'端分別引入SacI 和HindIII 酶切位點(diǎn)，然后將該序列與經(jīng)過(guò)相同酶切的pGL3-Basic 載體相連，構(gòu)建pGL3-3×PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒。所有的表達(dá)質(zhì)粒均經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定后用于后續(xù)研究。

1.3 抑制劑T0070907 對(duì)PPARγ基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響檢測(cè) 按TRIzol 說(shuō)明書(shū)提取DF-1 細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)T0070907 對(duì)DF-1 細(xì)胞內(nèi)源性PPARγ基因及LPL 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響。反應(yīng)體系為：FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（2×）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.6 μL，總 體 積10 μL；反 應(yīng) 條 件：95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件：95 ℃15 s，60 ℃10 min，95 ℃15 s。以雞NONO 基 因 為 內(nèi) 參，利 用2-ΔΔCt方 法 將 原 始Ct 值 轉(zhuǎn) 換為相對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平。引物信息見(jiàn)表1。

1.4 抑制劑T0070907 對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)的影響檢 測(cè) 將pCMV-HA-PPARγ1、pCMV-HA-PPARγ2真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后，向細(xì)胞中分別添加5 μmol/L 的T0070907（處理組）及DMSO（對(duì)照組）；添加48 h 后將DF-1 細(xì)胞用冷PBS洗滌后加入1 mL RIPA 緩沖液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；煮沸變性后經(jīng)12.5%的SDS-PAGE 檢測(cè)總蛋白的表達(dá)；以鼠源HA抗體（1∶1 000）和內(nèi)參β-actin（1∶1 000）為一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG（1∶3 000）為二抗室溫孵育1 h 后，westen blot 檢測(cè)T0070907 對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)的影響。

表1 引物信息Table 1 Primers information in this study

1.5 抑制劑T0070907對(duì)PPRE報(bào)告基因活性的影響檢測(cè) 將pGL3-3×PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后添加不同濃度（0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L）的T0070907，24 h 后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，分析T0070907 對(duì)PPRE 報(bào)告基因活性的影響；報(bào)告基因活性分析共進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，每次3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，報(bào)告基因活性用Fluc/Rluc 比值表示。

1.6 同時(shí)添加抑制劑T0070907 和激動(dòng)劑Rosi 對(duì)PPRE報(bào)告基因活性的影響檢測(cè) 將pGL3-3×PPRE報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞，24 h 后分別添加20 μmol/L PPARγ特異性激動(dòng)劑—羅格列酮（Rosi）、5 μmol/L T0070907 以 及20 μmol/L Rosi+5 μmol/L T0070907，24 h 后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，分析單獨(dú)添加Rosi、T0070907、共 同 添 加Rosi 和T0070907 對(duì)PPRE 報(bào) 告基因活性的影響；報(bào)告基因活性分析共進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，每次3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，報(bào)告基因活性用Fluc/Rluc 比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t 檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抑制劑T0070907 對(duì)PPARγ基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果 采用不同濃度的T0070907 處理DF-1 細(xì)胞，利用熒光定量PCR 檢測(cè)T0070907 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性PPARγ基因及LPL 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，隨著T0070907 濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性；在T0070907 濃度為1 μmol/L 時(shí)，處理組細(xì)胞內(nèi)PPARγ 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），至濃度為5 μmol/L 時(shí)兩組差異達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）（圖1A）。但不同濃度的T0070907 對(duì)細(xì)胞內(nèi)LPL 基因的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著影響（圖1B）。表明T0070907 能夠特異性地促進(jìn)DF-1 細(xì)胞中PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2.2 抑制劑T0070907 對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果 將過(guò)表達(dá)PPARγ1 或PPARγ2 的DF-1 細(xì)胞中分別添加不同濃度的T0070907，經(jīng)western blot檢測(cè)外源PPARγ蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，T0070907 處理細(xì)胞后，PPARγ2 蛋白表達(dá)量明顯增加，而PPARγ1 的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（圖2）。表明T0070907 對(duì)PPARγ 蛋白表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，但僅限于促進(jìn)PPARγ2 蛋白亞型的表達(dá)。

圖1 不同濃度T0070907 對(duì)DF-1 細(xì)胞中PPARγ基因和LPL 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Effects of T0070907 at different concentrations on the transcription levels of PPARγ gene and LPL gene in DF-1 cells

圖2 抑制劑T0070907 對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Effect of T0070907 on expression of PPARγ in DF-1 cells

2.3 抑制劑T0070907 對(duì)PPRE 報(bào)告基因活性影響的檢測(cè)結(jié)果 將轉(zhuǎn)染pGL3-3×PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒的DF-1 細(xì)胞中添加不同濃度的T0070907，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組隨著T0070907 濃度的增加，PPRE 報(bào)告基因活性逐漸增強(qiáng)，并且在濃度為0.5 μmol/L 時(shí)顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），濃度為2 μmol/L、5 μmol/L 時(shí)兩組差異達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）（圖3A）。表明T0070907 能夠顯著促進(jìn)PPRE 介導(dǎo)的熒光素酶的蛋白活性。

2.4 同時(shí)添加抑制劑T0070907 和激動(dòng)劑Rosi 對(duì)PPRE 報(bào)告基因活性影響的檢測(cè)結(jié)果 向轉(zhuǎn)染pGL3-3×PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒的DF-1 細(xì)胞中分別添加Rosi、T0070907 以及二者的混合物，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。結(jié)果顯示，單獨(dú)添加T0070907 與Rosi 均可顯著增強(qiáng)PPRE 報(bào)告基因活性（p＜0.05），添加T0070907 并不能降低Rosi 對(duì)PPRE報(bào)告基因活性的促進(jìn)作用（圖3B）。表明T0070907與Rosi 均可促進(jìn)PPRE 介導(dǎo)的熒光素酶的蛋白活性，并且T0070907 不能抑制Rosi 對(duì)PPRE 介導(dǎo)的熒光素酶蛋白活性的激活作用。

圖3 抑制劑T0070907 對(duì)PPRE 報(bào)告基因活性的影響Fig.3 Effect of inhibitor T0070907 on PPRE reporter gene activity

3 討 論

LEE 等研究發(fā)現(xiàn)，作為一種特異性的、高親和力的PPARγ拮抗劑，T0070907 在生化和細(xì)胞檢測(cè)中能夠阻斷PPARγ的活性[10]。T0070907 對(duì)PPARγ活性的抑制作用已在小鼠胰腺細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞的功能檢測(cè)中得以證實(shí)[12,14-15]，T0070907還可以通過(guò)一種PPARγ依賴(lài)的方式有效抑制脂肪生成[16]。然而本研究的結(jié)果顯示，T0070907 對(duì)DF-1 細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)無(wú)論是mRNA 轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平，以及蛋白活性均具有正向調(diào)節(jié)作用。

彭璇等研究顯示，在豬血管上皮細(xì)胞中，隨著T0070907 濃度的增加，PPARγ基因的表達(dá)量呈顯著下降[17]；Ge 等研究表明，T0070907 能夠抑制PPARγ表達(dá)的上調(diào)和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（Bavachinin）誘導(dǎo)的PPARγ向細(xì)胞核的遷移[18]。但本研究結(jié)果卻顯示DF-1 細(xì)胞內(nèi)，PPARγ基因的表達(dá)量隨著T0070907 濃度的增加逐漸升高，并在濃度為5 μmol/L 時(shí)極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01），而同樣濃度T0070907 的處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)LPL 基因的表達(dá)沒(méi)有影響，表明T0070907可以特異性地促進(jìn)PPARγ基因的表達(dá)。同時(shí)在蛋白水平上，本研究結(jié)果也顯示T0070907 對(duì)PPARγ的過(guò)表達(dá)效果有一定的促進(jìn)作用，表明T0070907 確實(shí)對(duì)PPARγ的表達(dá)有正調(diào)控作用。但T0070907 僅對(duì)DF-1細(xì)胞中的PPARγ2 的表達(dá)有效，對(duì)PPARγ1 的表達(dá)無(wú)影響，推測(cè)PPARγ的兩種蛋白亞型可能存在功能上的差異。

Zaytseva 等研究表明，T0070907 雖然不改變?nèi)巳橄侔┘?xì)胞內(nèi)PPARγ 蛋白的表達(dá)量，但可增加PPARγ的磷酸化水平，并顯著降低PPARγ與DNA 應(yīng)答元件的結(jié)合活性[19]。為進(jìn)一步確認(rèn)T0070907 對(duì)PPARγ表達(dá)的作用，本研究利用含PPRE 反應(yīng)元件的報(bào)告基因質(zhì)粒來(lái)分析T0070907 對(duì)PPARγ活性的影響。PPARγ是核受體PPAR 子集的同種型，其還包括PPARα和PPARβ。PPAR 被其配體激活后，可與維甲酸X 受體（Retinoic acid X receptor，RXR）形成異二聚體，再與靶基因啟動(dòng)子中的一段特定的DNA 序列—PPRE 結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。PPRE 是由2 個(gè)以AGGTCA 為核心的正向重復(fù)序列組成，中間大多被1 或2 個(gè)核苷酸隔開(kāi)，分別與PPARs 和RXR 結(jié)合。這種PPRE 存在于參與脂質(zhì)代謝和體內(nèi)平衡的基因中，常被用來(lái)克隆、構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒，檢測(cè)PPAR 的調(diào)控作用或配基篩選[20]。因此，本研究通過(guò)比較PPRE 報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性變化，結(jié)果顯示T0070907 可以顯著增強(qiáng)PPRE 介導(dǎo)的熒光素酶的蛋白活性，并且T0070907不能抑制Rosi 對(duì)PPRE 介導(dǎo)的熒光素酶蛋白活性的激活作用，提示T0070907 能夠促進(jìn)PPARγ的蛋白活性，使其與靶基因的PPRE 結(jié)合，增強(qiáng)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控作用。

綜上，本研究結(jié)果表明T0070907 對(duì)DF-1 細(xì)胞中PPARγ基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、PPARγ2 蛋白表達(dá)以及PPARγ的蛋白活性均具有正向調(diào)節(jié)作用。該結(jié)果為開(kāi)展雞PPARγ的功能研究提供了有益的數(shù)據(jù)，并提示，與哺乳動(dòng)物不同，雞PPARγ可能具有其獨(dú)特的表達(dá)方式和調(diào)控機(jī)制。