袁娟，牟宗春，游佳，馬維駿

·論著·

利用合適的啟動子提高外源基因在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)

袁娟，牟宗春，游佳，馬維駿

目的通過選擇合適的啟動子來實(shí)現(xiàn)外源基因在 Jurkat 細(xì)胞中的高效表達(dá)。

Jurkat 細(xì)胞； 啟動區(qū)（遺傳學(xué)）； 基因，報告； 螢光素酶類

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):281-285

Jurkat 細(xì)胞是一種分離自白血病患者外周血T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系[1]，通常用于細(xì)胞因子受體表達(dá)、T 淋巴細(xì)胞信號通路、T 淋巴細(xì)胞激活、癌癥對藥物和放射耐受差異的機(jī)制、急性 T 淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制以及治療方法等方面的研究[2-3]。該細(xì)胞在植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）或者刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）刺激下能夠產(chǎn)生大量的 IL-2，且其產(chǎn)生的 IL-2 能夠促進(jìn)已被抗原激活的效應(yīng) T 淋巴細(xì)胞的增殖[2]。因此，Jurkat 細(xì)胞是一種研究哺乳動物 T 淋巴細(xì)胞以及免疫相關(guān)功能的良好工具。哺乳動物細(xì)胞中這些功能的研究，常常需要有效的啟動子過表達(dá)相關(guān)基因。啟動子是基因表達(dá)的“開關(guān)”之一，其對基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。在真核生物中，不同的轉(zhuǎn)錄因子可以與相應(yīng)的啟動子序列結(jié)合，從而精確地調(diào)控基因表達(dá)的時間和水平[4]。因此，選擇具有高表達(dá)活性的啟動子對驅(qū)動基因高效表達(dá)是非常關(guān)鍵的。在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中，一般選擇表達(dá)活性較強(qiáng)的病毒啟動子[5-7]，如猿猴病毒 40 （simian virus 40，SV40）早期啟動子、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）即刻早期啟動子。但是在有些哺乳動物細(xì)胞中，例如 Jurkat 細(xì)胞系中，SV40 和 CMV 啟動子的活性并不高[8-9]。而一些細(xì)胞啟動子，如人源的延長因子 1α（elongation factor-1，EF1α）啟動子、人源的泛素 C（ubiquitin C，UbC）啟動子也是能高效表達(dá)外源基因的啟動子[10-11]?；谝陨弦蛩?，我們利用熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)檢測 SV40、CMV 啟動子與 EF1α、UbC啟動子在 Jurkat 細(xì)胞中的相對活性，通過高活性啟動子來實(shí)現(xiàn)外源基因在 Jurkat 細(xì)胞中的高效表達(dá)，以利于 Jurkat 細(xì)胞系在哺乳動物 T 淋巴細(xì)胞以及免疫相關(guān)功能研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 人 T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株 Jurkat（Clone E6-1）來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。美國 Promega 公司的 pGL3 control 質(zhì)粒含有 SV40 啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）報告基因。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 pGL3-MCS 質(zhì)粒含有 pGL3-control 質(zhì)粒的全長序列和位于 Fluc 編碼區(qū)下游的一段多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS）序列。美國Invitrogen 公司的 pcDNA3.1/myc-His(-) 質(zhì)粒含有CMV 啟動子。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所楊黃恬研究組構(gòu)建的 pEF1α-EGFP質(zhì)粒含有人源 EF1α 啟動子[11]。美國加州理工學(xué)院David Baltimore 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 FUGW 質(zhì)粒含有人源 UbC 啟動子[12]。美國 Promega 公司的pRL-TK 質(zhì)粒含有單純胞疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）啟動子驅(qū)動的海腎熒光素酶（renilla luciferase，Rluc）報告基因。

1.1.2試劑及儀器 特級胎牛血清、OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；Lipofectamine-2000購自美國 Invitrogen 公司；RPMI-1640 液體培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System 購自美國 Promega 公司；限制性內(nèi)切酶 Ase I 和 Pac I 購自美國 NEB 公司；其他限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 聚合酶和 T4 DNA連接酶購自日本 TaKaRa 公司；Lumat LB 9507 型化學(xué)發(fā)光檢測儀購自德國 Berthold Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒載體片段和 DNA 片段的制備 利用Bgl II 和 Hind III 酶切位點(diǎn)，將 CMV 啟動子克隆到 pGL3-MCS 中 Fluc 編碼區(qū)的上游，構(gòu)建出質(zhì)粒 pGL3-CMV。用 Bgl II 和 Hind III 分別對pcDNA3.1/myc-His(-) 和 pGL3-MCS 進(jìn)行雙酶切。

利用 Ase I、Bgl II 和 Hind III 酶切位點(diǎn)，將EF1α 啟動子克隆到 pGL3-MCS 中 Fluc 編碼區(qū)的上游構(gòu)建出質(zhì)粒 pGL3-EF1α。將質(zhì)粒 pEF1α-EGFP 用 Ase I 酶切后用 T4 DNA 聚合酶補(bǔ)平粘性末端，然后用 Hind III 酶切。將質(zhì)粒 pGL3-MCS 用 Bgl II 酶切后用 T4 DNA 聚合酶補(bǔ)平粘性末端，然后用 Hind III 酶切。

利用 Pac I、Sma I 和 Nco I 酶切位點(diǎn)，將UbC 啟動子克隆到 pGL3-MCS 中 Fluc 編碼區(qū)的上游，構(gòu)建出質(zhì)粒 pGL3-UbC。將質(zhì)粒 FUGW 用 Pac I 酶切后用 T4 DNA 聚合酶補(bǔ)平粘性末端，然后用 Nco I 酶切。將質(zhì)粒 pGL3-MCS 用Sma I 和 Nco I 進(jìn)行雙酶切。

酶切反應(yīng)、粘性末端補(bǔ)平反應(yīng)、連接反應(yīng)均按相應(yīng)公司提供的說明書進(jìn)行操作。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用 T4 DNA 連接酶連接載體片段與相應(yīng)的 DNA 片段。轉(zhuǎn)化 E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后將挑取的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取菌體中的質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。各個重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證所用的限制性內(nèi)切酶分別如下：pGL3-CMV 用 Bgl II 與 Hind III，pGL3-EF1α 用Hind III 與 Kpn I，pGL3-UbC 用 Nco I 與 Kpn I。

1.2.3細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 細(xì)胞以 2 × 105個/ml的起始密度培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，該完全培養(yǎng)基為含10％ 特級胎牛血清的 RPMI-1640。細(xì)胞置于含5％ CO2的 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 48 h 傳代一次。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)的 Jurkat 細(xì)胞低速離心后去凈上清，加入新鮮的完全培養(yǎng)基后調(diào)整細(xì)胞密度為 4 × 105個/ml 并分至 24 孔板中，每孔500 μl，置于含 5％ CO2的 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。將 400 ng Fluc 質(zhì)粒和 400 ng Rluc 質(zhì)粒一起加入 50 μl 37 ℃ 預(yù)熱的 OPTI-MEM 培養(yǎng)基中混勻。將 2 μl Lipofectamine-2000 加入 50 μl 37 ℃預(yù)熱的 OPTI-MEM 培養(yǎng)基中并輕輕混勻，室溫靜置 5 min。將混有雙報告基因質(zhì)粒的 OPTI-MEM培養(yǎng)基加入到混有 Lipofectamine-2000 的 OPTIMEM 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置 20 min。將混合液逐滴加入 24 孔板中的 Jurkat 細(xì)胞中，輕輕晃動培養(yǎng)板混勻，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。

1.2.5細(xì)胞裂解物的制備、報告基因熒光素酶活性的測定和數(shù)據(jù)分析 收集轉(zhuǎn)染了雙報告基因的Jurkat 細(xì)胞，600 × g 離心 3 min，去凈上清培養(yǎng)基。加入 1 ml PBS 重懸細(xì)胞后 600 × g離心 3 min，去凈上清。按照 Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書用裂解液處理收集的 Jurkat 細(xì)胞。取 10 μl 細(xì)胞裂解物并用化學(xué)發(fā)光檢測儀分別檢測其中 Fluc 和 Rluc 與相應(yīng)底物反應(yīng)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞裂解物中 Fluc 與相應(yīng)底物反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與 Fluc 的酶活成正比。以 Rluc的熒光強(qiáng)度作為內(nèi)參照對 Fluc 的熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理即計(jì)算細(xì)胞裂解物中 Fluc 熒光強(qiáng)度與Rluc 熒光強(qiáng)度的比值，該比值即為 Fluc的相對酶活。

2 結(jié)果

2.1 不同啟動子驅(qū)動 Fluc 報告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定

不同啟動子驅(qū)動 Fluc 報告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)簡圖如圖 1。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒均具有相同的 Fluc 報告基因，不同重組質(zhì)粒之間的區(qū)別僅在于驅(qū)動報告基因的啟動子部分。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證后得到的片段大小分別約為 1 與 5.1 kb、1.25 與 5.1 kb、1.25 與5.1 kb。酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示的片段大小與預(yù)期結(jié)果相吻合（圖 2）。初步證明了重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將各個重組質(zhì)粒所插入的 DNA 片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果與 NCBI Genbank 上所公布的相應(yīng)啟動子的序列一致。

2.2 Jurkat 細(xì)胞中不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因相對酶活的檢測

將不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因與內(nèi)參Rluc 報告基因共同轉(zhuǎn)入 Jurkat 細(xì)胞中。24 h 后檢測細(xì)胞裂解物中熒光素酶 Fluc 及 Rluc 與相應(yīng)底物反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。根據(jù)Dual-Luciferase?Reporter Assay System 說明書，熒光素酶報告基因酶活檢測的線性范圍為 0.1 ～ 100 萬。研究中TK 啟動子驅(qū)動的 Rluc 報告基因酶活絕對值在2 萬 ～ 3 萬，不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因酶活絕對值在 3 萬 ～ 70 萬，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果均在檢測線性范圍之內(nèi)。質(zhì)粒 pGL3-MCS、pGL3-CMV、pGL3-EF1α 和 pGL3-UbC 的 Fluc 相對酶活分別為 1.2 ± 0.1、2.8 ± 0.5、22.2 ± 1.0、35.6 ± 5.1（圖 3）。所構(gòu)建的不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因均以pGL3-MCS 質(zhì)粒為載體，各個質(zhì)粒的區(qū)別僅在于啟動子部分（圖 1）。Fluc 的酶活與 Fluc 的表達(dá)量成正比，F(xiàn)luc 表達(dá)量的多少是由驅(qū)動其表達(dá)的啟動子活性的強(qiáng)弱決定的。因此，F(xiàn)luc 酶活的高低是由啟動子表達(dá)活性的強(qiáng)弱決定的。由以上分析得出，在 Jurkat 細(xì)胞中，4 個啟動子的表達(dá)活性高低為：UbC ＞ EF1α ＞ CMV ＞ SV40。其中，SV40 和CMV 啟動子的表達(dá)活性分別只有 UbC 啟動子的3.4％ 和 7.9％ 左右。在 Jurkat 細(xì)胞中，我們所比較的這 4 個啟動子，UbC 啟動子的表達(dá)活性是最高的，而 SV40 啟動子的表達(dá)活性是最低的。

圖1 不同啟動子驅(qū)動 Fluc 報告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)簡圖Figure 1 Structure diagram of recombinant plasmids containing Fluc reporter gene driven by different promoter

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Agarose gel electrophoresis of double digestion of recombinant plasmids

圖3 Jurkat 細(xì)胞中不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因相對酶活的檢測（結(jié)果為 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，P＜ 0.05）Figure 3 Measurement of relative activity of different promoter-driven Fluc reporter genes in Jurkat cells (Results shown are representative of three independent experiments. Error bars represent the standard deviation.P＜ 0.05)

3 討論

雙報告基因系統(tǒng)廣泛用于研究真核細(xì)胞的基因表達(dá)和生理特性。應(yīng)用的范圍包括研究受體的活性、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)的信號、mRNA 加工、蛋白折疊等[13]。雙報告基因系統(tǒng)是同時表達(dá)和檢測單一系統(tǒng)內(nèi)的兩個報告基因。其中，實(shí)驗(yàn)報告基因是與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的，而內(nèi)參報告基因則提供一個對內(nèi)部系統(tǒng)的控制。通過內(nèi)參報告基因可以校正由移液器的誤差和轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活性、細(xì)胞裂解效率、細(xì)胞檢測效率的差異所引起的對實(shí)驗(yàn)報告基因的干擾[13]。因此，雙報告基因系統(tǒng)可以減少干擾而提供更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。我們所選擇的雙報告基因系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)報告基因是 Fluc，內(nèi)參報告基因是Rluc，該系統(tǒng)中所選用的熒光素酶具有高度的靈敏性和很寬的線性范圍，是廣泛使用的報告基因[14]。因此，本研究中所采用的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)是一種有效、方便和快速的檢測方法。

在 Jurkat 細(xì)胞中，我們觀察到 SV40 和CMV 啟動子的表達(dá)活性均比較低，而 EF1α 和UbC 啟動子的表達(dá)活性較高。有文獻(xiàn)報道，在不同細(xì)胞中，SV40 或 CMV 啟動子的活性相差懸殊，這兩個啟動子并非是驅(qū)動哺乳動物細(xì)胞中外源基因高效表達(dá)的最佳選擇[8, 15]。細(xì)胞中的一些轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾，如 NF-κb、DNA 甲基化等，能調(diào)控 SV40 和 CMV 啟動子的活性[16-17]。如DNA 甲基化可以抑制 Sp1 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到病毒啟動子上從而降低其起始轉(zhuǎn)錄活性[17]，這些因素都有可能影響 SV40 和 CMV 啟動子在不同細(xì)胞中的表達(dá)活性。組成型表達(dá)的人源 EF1α 啟動子和UbC 啟動子是在哺乳動物細(xì)胞中廣泛使用的啟動子[10-12, 15]，與病毒啟動子相比，其細(xì)胞來源的特性以及組成型表達(dá)的特點(diǎn)可能使它們更加適合驅(qū)動外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的高效表達(dá)。

許多研究中對于啟動子的選擇通常取決于實(shí)驗(yàn)材料的可利用性，而不是實(shí)驗(yàn)材料的合適性。為了能在 Jurkat 細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因以利于我們對其在免疫以及癌癥等相關(guān)疾病功能基因的研究，我們利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)比較了哺乳動物細(xì)胞中常用的病毒啟動子和人源啟動子在Jurkat 細(xì)胞中的活性。我們所做的比較可以為選擇高表達(dá)活性啟動子進(jìn)行外源基因在 Jurkat 細(xì)胞中的高效表達(dá)提供依據(jù)。這對 Jurkat 細(xì)胞系更好地應(yīng)用在免疫以及癌癥等相關(guān)疾病的研究具有重要意義。

志謝感謝中國科學(xué)院上海巴斯德研究所藍(lán)柯研究組、李斌研究組贈予質(zhì)粒。感謝中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所楊黃恬研究組贈予質(zhì)粒。

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Enhancement of exogenous gene expression in Jurkat cells by efficient promoter

YUAN Juan, MOU Zong-chun, YOU Jia, MA Wei-jun

ObjectiveTo select promoters to enhance exogenous gene expression in Jurkat cells.MethodsFirefly luciferase (Fluc)-expressing plasmids driven by different promoters (SV40, CMV, EF1α, UbC) were constructed on the basis of pGL3-MCS. Fluc-expressing plasmids were co-transfected into Jurkat cells with renilla luciferase (Rluc)-expressing plasmid serving as an internal control. The fluorescent signal generated from the reaction of the two luciferases with the respective substrates was measured, and the ratio of fluorescent signal of Fluc and Rluc was calculated, which was defined as the relative activity of the Fluc.ResultsUsing CMV, EF1α and UbC promoters, we constructed pGL3-CMV, pGL3-EF1α and pGL3-UbC recombinant plasmids to express Fluc reporter gene. The relative Fluc’s activity driven by different promoters in Jurkat cells is pGL3-UbC ＞ pGL3-EF1α ＞pGL3-CMV ＞ pGL3-MCS.ConclusionThe human ubiquitin C promoter efficiently enhances the expression of exogenous gene in Jurkat cells, which facilitates the application of Jurkat cells in the study of mammalian T lymphocytes and immune function.

Jurkat cells; Promoter, regions (Genetics); Genes, reporter; Luciferases

MA Wei-jun, Email: wjma@sibs.ac.cn.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.006

200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所

馬維駿，Email：wjma@sibs.ac.cn

2012-04-16

方法以 pGL3-MCS 質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建不同啟動子（SV40、CMV、EF1α 和 UbC）驅(qū)動螢火蟲熒光素酶 Fluc 報告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒，并將其與作為內(nèi)參的表達(dá)海腎熒光素酶Rluc 報告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn) Jurkat 細(xì)胞，檢測 Jurkat 細(xì)胞中這兩種熒光素酶與相應(yīng)底物反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，計(jì)算Fluc 與 Rluc 熒光強(qiáng)度的比值即 Fluc 的相對酶活，通過比較 Fluc 相對酶活的大小來選取在 Jurkat 細(xì)胞中具有高表達(dá)活性的啟動子。

結(jié)果以 pGL3-MCS 質(zhì)粒為基礎(chǔ)成功構(gòu)建了不同啟動子驅(qū)動 Fluc 報告基因表達(dá)的重組質(zhì)粒 pGL3-CMV、pGL3-EF1α 和 pGL3-UbC。在 Jurkat 細(xì)胞中，不同啟動子驅(qū)動的 Fluc 報告基因的相對酶活的強(qiáng)弱關(guān)系為pGL3-UbC ＞ pGL3-EF1α ＞ pGL3-CMV ＞ pGL3-MCS。

結(jié)論可以選擇高活性的人源泛素 C 啟動子實(shí)現(xiàn)外源基因在 Jurkat 細(xì)胞中的高效表達(dá)，以利于 Jurkat 細(xì)胞系在哺乳動物 T 淋巴細(xì)胞以及免疫相關(guān)功能研究中的應(yīng)用。

Author Affiliat ions:Institute of Health Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine ＆ Shanghai Institutes for Biological Sciences Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200025, China (YUAN Juan); Institute of Health Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciences Chinese Academy of Sciences ＆ Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China (MOU Zong-chun, YOU Jia, MA Wei-jun)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):281-285