李 淼，張衛(wèi)善

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院1Med-X研究院腫瘤精準(zhǔn)治療研究室，2醫(yī)學(xué)影像科，陜西 西安 710061

微小核糖核酸（microRNA）是一類可互補(bǔ)結(jié)合靶基因信使核糖核酸（mRNA）3’-端非翻譯區(qū)（3’-UTR），繼而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯的內(nèi)源非編碼單鏈核酸［1-2］。其中miR-21是一種表達(dá)于多數(shù)實(shí)體腫瘤的常見microRNA，是可靠的惡性腫瘤標(biāo)志物［3］，以及反義RNA 干擾抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［4］。目前檢測microRNA 常用的Northern 雜交、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、微陣列等體外方法［5］，存在操作復(fù)雜、難以觀察活細(xì)胞內(nèi)microRNA表達(dá)等問題。將分子影像學(xué)與報(bào)告基因方法相結(jié)合，可展示基因的原位表達(dá)情況，一定程度上彌補(bǔ)了上述不足［6］。典型的報(bào)告基因體系，如I型單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV1-tk）報(bào)告基因，結(jié)合9-［4-［18F］氟-3-(羥甲基)丁基］鳥嘌呤（［18F］FHBG）示蹤劑和正電子發(fā)生斷層成像（PET），已獲美國食藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于臨床成像［7］。

已報(bào)道的microRNA表達(dá)報(bào)告基因活體成像策略有［8］：（1）整合原microRNA啟動(dòng)子基因與光學(xué)報(bào)告基因，構(gòu)建直接展示相應(yīng)microRNA表達(dá)調(diào)控的融合基因，即經(jīng)典的直接表征策略，僅能反映microRNA表達(dá)調(diào)控而非實(shí)際表達(dá)水平［9］；（2）新興的基于納米材料的核酸雜交活化傳感靶向探針，激發(fā)光學(xué)或磁共振信號(hào)的策略，需構(gòu)建復(fù)雜的包裝探針，其生物相容性尚不夠理想［10］；（3）構(gòu)建含有報(bào)告基因與microRNA互補(bǔ)結(jié)合靶序列的融合表達(dá)載體策略，是目前最常用的策略，可直接響應(yīng)內(nèi)源性microRNA的調(diào)控效應(yīng)，且應(yīng)用不受成像模態(tài)的限制［11-12］。有鑒于光學(xué)模態(tài)在檢測便捷性方面相較其他成像模態(tài)有明顯優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于報(bào)告基因成像，而前述成熟的HSV1-tk/［18F］FHBG體系是基于放射性示蹤劑的報(bào)告基因體系。為嘗試基于單一種類放射性示蹤劑實(shí)現(xiàn)光學(xué)/核素協(xié)同成像［13］，本研究擬整合策略（3）與HSV1-tk/［18F］FHBG體系，構(gòu)建通過契倫科夫光學(xué)模態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)進(jìn)行可視化表征的新型報(bào)告基因成像方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

A549肺癌細(xì)胞系（典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC）；添加了葡萄糖、1%青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清（Gemini）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco），Lipofectamine脂質(zhì)體及配套轉(zhuǎn)染試劑盒、胰酶和乙二胺基四乙酸（EDTA）（Invitrogen）；In vivo-jetPEI陽離子聚合物活體轉(zhuǎn)染載體試劑（Polyplus Transfection）；陰離子交換樹脂/中性氧化鋁/十八烷基鍵合硅膠固相萃取小柱（Sep-Pak Accell QMA/Alumina N/C18 Light;Waters），4,7,13,16,21,24-六氧雜-1,10-二氮雜雙環(huán)［8,8,8］廿六烷（Kryptofix 2.2.2,K222;Merck），N2-(對(duì)甲氧苯基二苯基甲基)-9-［(4-甲苯磺?；?-3-對(duì)甲氧苯基二苯基甲氧基-甲基丁基］鳥嘌呤前體（ABX）；無水乙腈、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）均為分析純（Sigma-Aldrich），乙醇為藥典級(jí)（Merck）。

1.2 質(zhì)粒載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)

PCR擴(kuò)增HSV1-tk基因并插入pcDNA3.1質(zhì)粒的XhoI和EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體。合成三聯(lián)miR-21互補(bǔ)結(jié)合靶基因（3×miR-21t）序列并退火：有義鏈5'-GGCCGCTAGCTTATCAGACTGATGTTGATAGCTT ATCAGACTGATGTTGATAGCTTATCAGACTGATG TTGAT-3'及反義鏈5'-CTAGATCAACATCAGTCT GATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCA ACATCAGTCTGATAAGCTAGC-3'，然后插入CMVHSV1-tk基因下游3’-UTR區(qū)域的KpnI和BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建CMV-HSV1-tk-3×miR-21t報(bào)告基因載體（圖1）［14］。

圖1 CMV-HSV1-tk-3×miR-21t/［18F］FHBG報(bào)告基因成像體系原理示意圖.Fig.1 Schematic diagram of the CMV-HSV1-tk-3×miR-21t/［18F］FHBG reporter gene system.

采用上述轉(zhuǎn)染試劑盒將上述報(bào)告基因載體瞬轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，得穩(wěn)定表達(dá)CMV-HSV1-tk-3×miR-21t報(bào)告基因載體的A549細(xì)胞（A549T細(xì)胞）。所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，至鋪滿瓶底70%面積時(shí)傳代。

1.3 ［18F］FHBG制備

［18F］F-離子基于PETtrace回旋加速器（GE）通過核反應(yīng)18O(p,n)18F制備。用能量為16.4 MeV、強(qiáng)度5 mA的質(zhì)子束流轟擊靶水［18O］H2O（純度97%）30 min。富集靶水中的［18F］F-到QMA柱，用K2CO3（3 mg,0.5 mL水溶液）與K222（15 mg,1 mL 無水乙腈溶液）洗脫收集。［18F］FHBG的標(biāo)記制備在TRACERLab FXFN自動(dòng)合成儀（GE）上通過親核取代反應(yīng)進(jìn)行：將［18F］F-加熱抽真空共沸，另加無水乙腈同法干燥，加前體（2 mg,0.6 mL無水乙腈溶液），120 ℃反應(yīng)10 min，冷卻后加HCl（1 mol/L，0.5 mL），95 ℃水解5 min，冷卻后加NaOH（2 mol/L，0.25 mL）中和，反應(yīng)體系過Alumina N/C18串聯(lián)柱，水（5 mL）洗滌C18柱，乙醇（2 mL）洗脫產(chǎn)物，加磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）稀釋，過濾除菌后立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［15］。

1.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞成像及γ計(jì)數(shù)

將A549T 細(xì)胞接種于12 孔板中［（0.31～5）×105/孔］，培養(yǎng)12 h貼底。加［18F］FHBG（107kBq/孔）孵育120 min。加4 °C預(yù)冷PBS洗3次，0.25%胰酶-0.02%EDTA溶液消化；細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入96孔板進(jìn)行契倫科夫光學(xué)成像和γ計(jì)數(shù)；另將A549T細(xì)胞接種于12孔板中（5×105/孔），培養(yǎng)12 h貼底后，采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染反義寡聚miR-21（Anti-miR-21；終濃度25～100 nmol/L），培養(yǎng)24 h；同法加［18F］FHBG成像及γ計(jì)數(shù)［16］。

契倫科夫成像采用IVIS Spectrum光學(xué)成像系統(tǒng)（PerkinElmer）曝光5 min，其余參數(shù)為默認(rèn)值。用Advanced Acquisition and Analysis Tools 軟件（PerkinElmer）手動(dòng)勾劃感興趣區(qū)（ROI）并提取發(fā)射光強(qiáng)度。采用Wizard 2480自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器（PerkinElmer）測定γ計(jì)數(shù)率。

1.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系移植瘤模型成像

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作依照當(dāng)?shù)毓俜胶妥髡咚趩挝坏膭?dòng)物福利及研究倫理相關(guān)規(guī)定設(shè)計(jì)和執(zhí)行。移植瘤模型采用4～5周齡無胸腺雌裸鼠（Envigo）構(gòu)建。接種前將A549T細(xì)胞重懸于預(yù)冷PBS并與基質(zhì)膠混合（1∶1,v/v）并置于冰上。細(xì)胞懸液注射至右后肢外側(cè)皮下（5×106/只）?？ǔ邷y定移植瘤體直徑，待其體積（瘤體積=π×短徑2×長徑/6）≥200 mm3時(shí)，將小鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，5只/組。實(shí)驗(yàn)組采用In vivo-jetPEI 試劑（0.1 mL）與Anti-miR-21（50 mg）混合，于小鼠瘤內(nèi)注射，對(duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射In vivo-jetPEI 試劑與對(duì)照RNA 混合物（50 mg）。24 h后，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射［18F］FHBG（3.7 MBq/300 μL），1 h后以異氟烷吸入法麻醉小鼠；取俯臥位采集契倫科夫光學(xué)圖像，曝光2 min，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料的組間比較均采用Student'st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線性相關(guān)回歸分析在Prism 8軟件（GraphPad）上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞數(shù)量與成像信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)性

A549T細(xì)胞與［18F］FHBG共孵育后，成像信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量之間的線性回歸分析結(jié)果顯示，契倫科夫光學(xué)圖像上顯示的信號(hào)強(qiáng)度隨著細(xì)胞數(shù)量倍增而同步增強(qiáng)（圖2A）。契倫科夫光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)良好的線性正相關(guān)（R2=0.9962，圖2B）。此外，放射性γ計(jì)數(shù)率與A549T細(xì)胞數(shù)量之間也呈現(xiàn)顯著的線性正相關(guān)（R2=0.9807，圖2C）。

圖2 穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因載體的梯度數(shù)量A549T細(xì)胞與［18F］FHBG共孵育120 min后的成像信號(hào).Fig.2 The signals transmitted by the A549T cells in gratitude number stably expressing the reporter gene vector after the incubation with［18F］FHBG for 120 min.

2.2 反義寡聚miR-21對(duì)成像信號(hào)的調(diào)控作用

經(jīng)梯度劑量Anti-miR-21 處理的A549T 細(xì)胞與［18F］FHBG孵育后的成像信號(hào)強(qiáng)度測定結(jié)果顯示，契倫科夫光學(xué)圖像上顯示的信號(hào)強(qiáng)度隨著Anti-miR-21濃度倍增而同步增強(qiáng)（圖3A）；契倫科夫光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度與Anti-miR-21濃度呈現(xiàn)正向劑量依賴關(guān)系（圖3B）。此外，放射性γ計(jì)數(shù)率也隨著Anti-miR-21濃度倍增而同步上升，呈劑量依賴性正相關(guān)（圖3C）。

圖3 加入梯度劑量反義寡聚miR-21處理的穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因載體的A549T細(xì)胞與［18F］FHBG共孵育120 min后的成像信號(hào)Fig.3 The signals transmitted by the A549T cells stably expressing the reporter gene vector after the treatment with antisense oligomeric miR-21 in gratitude concentration and the subsqeuent incubation with［18F］FHBG for 120 min.

在瘤內(nèi)注射Anti-miR-21（實(shí)驗(yàn)組）或混合RNA（對(duì)照組）的A549T皮下瘤模型（n=5）給藥［18F］FHBG后的契倫科夫光學(xué)圖像中，實(shí)驗(yàn)組瘤體輪廓清晰可見；而對(duì)照組瘤體輪廓難以與背景組織區(qū)分；且上述2組之間移植瘤信號(hào)的視覺對(duì)比非常明顯（圖4），在活體水平有效展示了上述報(bào)告基因?qū)?nèi)源性miR-21抑制HSV1-tk表達(dá)活性的響應(yīng)，以及Anti-miR-21對(duì)miR-21功能的序列特異性抑制作用。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因載體的A549T細(xì)胞皮下移植瘤模型小鼠在注射［18F］FHBG 2 h后的典型活體契倫科夫光學(xué)圖像.Fig.4 The typical in vivo Cerenkov images of subcutaneous A549T xenograft model stably expressing the reporter gene vector at 2 h after the injection of［18F］FHBG.

3 討論

已知在細(xì)胞內(nèi)>60%的mRNA表達(dá)可被microRNA調(diào)控。就種類而言，microRNA與mRNA之間的調(diào)控關(guān)系是一個(gè)復(fù)雜的交叉網(wǎng)絡(luò)。揭示microRNA的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)表達(dá)模式將有助于闡明microRNA調(diào)控的機(jī)制，具有重要的研究及臨床意義［17］。已知microRNA miR-21在癌癥的起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。一些腫瘤類型依賴miR-21的表達(dá)以維持其惡性表型［4］。因此對(duì)miR-21在腫瘤組織或細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行成像，不僅有望作為腫瘤診斷標(biāo)志物，也可用于分析相關(guān)信號(hào)通路和構(gòu)建miR-21靶向藥物研究模型［16］

本研究構(gòu)建報(bào)告基因體系的總體設(shè)計(jì)原理如下：在HSV1-tk基因下游3’-UTR區(qū)域構(gòu)建三聯(lián)miR-21靶基因序列（3×miR-21t）；3×miR-21t序列可被細(xì)胞的內(nèi)源性miR-21互補(bǔ)結(jié)合；當(dāng)內(nèi)源性miR-21表達(dá)時(shí)，miR-21結(jié)合3×miR-21t序列，從而抑制HSV1-tk基因表達(dá)，即負(fù)向調(diào)控；外源加入的Anti-miR-21可通過互補(bǔ)配對(duì)使miR-21的功能沉默，從而恢復(fù)HSV1-tk的表達(dá)及其活性，即正向調(diào)控；HSV1-tk的磷酸激酶活性可使進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的［18F］FHBG被磷酸化，無法再轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，從而蓄積在胞內(nèi)，并持續(xù)發(fā)射γ射線和契倫科夫光學(xué)信號(hào)。

為了驗(yàn)證本文所構(gòu)建的報(bào)告基因成像體系的定量可靠性，本研究分析了A549T細(xì)胞與［18F］FHBG共孵育后的成像信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量之間的線性相關(guān)性，結(jié)果顯示上述報(bào)告基因體系的表達(dá)及其功能活性是穩(wěn)定均一的；在不超過5×105細(xì)胞的范圍內(nèi)，契倫科夫光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度可準(zhǔn)確反映細(xì)胞數(shù)量。這說明上述報(bào)告基因體系具備較好的定量能力。為驗(yàn)證上述報(bào)告基因系統(tǒng)的特異性，本研究還測定了經(jīng)梯度劑量Anti-miR-21處理的A549T細(xì)胞與［18F］FHBG孵育后的成像信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果顯示Anti-miR-21確可靶向性地發(fā)揮作用，抑制miR-21下調(diào)HSV1-tk基因表達(dá)的功能。此外，在本研究中還觀察到契倫科夫光學(xué)定量信號(hào)與射線直接定量信號(hào)之間能相互匹配。結(jié)合活體成像結(jié)果可知，上述報(bào)告基因體系在契倫科夫光學(xué)模態(tài)下能特異性地準(zhǔn)確表征靶組織腫瘤細(xì)胞內(nèi)microRNA的表達(dá)和分布情況。

目前報(bào)道最多的miR-21 活體成像策略是基于miR-21 雜交活化激發(fā)信號(hào)原理的靶向納米材料探針［18-21］。既往有研究者基于熒光素酶報(bào)告基因與miR-21靶序列融合表達(dá)載體，利用內(nèi)源性microRNA發(fā)揮小干擾RNA的功能，以下調(diào)或關(guān)閉報(bào)告基因表達(dá)，對(duì)荷瘤模型鼠進(jìn)行了生物發(fā)光成像，取得了良好效果［22］。而理論上更換其他報(bào)告基因類型，應(yīng)可適用于相應(yīng)的成像模態(tài)。因此在上述經(jīng)典報(bào)告基因成像策略的基礎(chǔ)上，本研究選擇已廣泛用于核素成像的HSV1-tk與［18F］FHBG的組合，盡量利用成熟原理和成像設(shè)備，構(gòu)建了針對(duì)miR-21表達(dá)的新型報(bào)告基因體系，提供了一種對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)進(jìn)行便捷、實(shí)時(shí)、定量可視化的新方法。

據(jù)筆者所知，本文是首例基于HSV1-tk/［18F］FHBG激酶報(bào)告基因體系，對(duì)microRNA的表達(dá)進(jìn)行契倫科夫光學(xué)靶向成像的報(bào)道。在報(bào)告基因成像常用的核素成像、光學(xué)成像、磁共振成像這3種模態(tài)中，光學(xué)模態(tài)在空間分辨率、敏感度方面位于中間；雖在組織透射能力、定量準(zhǔn)確度方面還不夠理想，但在設(shè)備成本、操作便捷性方面則優(yōu)于其他模態(tài)。在光學(xué)模態(tài)中，熒光成像便于多通道檢測，但依賴外源激發(fā)光，活體組織自發(fā)熒光背景干擾較強(qiáng)，不利于負(fù)向調(diào)控報(bào)告基因的信號(hào)采集；生物發(fā)光無需激發(fā)光源，特異性較強(qiáng)，背景對(duì)比度較高，但需在成像前給藥發(fā)光底物（例如熒光素），且敏感度偏低；契倫科夫光學(xué)模態(tài)最顯著的特征是其基于放射性示蹤劑，靈敏度高，發(fā)射光譜范圍寬［23］，還可整合光學(xué)與核素成像的優(yōu)勢。同其他光學(xué)成像模態(tài)一樣，契倫科夫光學(xué)信號(hào)的組織透射能力也相對(duì)有限，其信號(hào)強(qiáng)度會(huì)受到組織吸收散射的干擾。本研究所用動(dòng)物模型的皮下移植瘤屬于淺表組織，受到上述影響較小，進(jìn)行組間的契倫科夫光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度比較尚屬可行。

本研究的局限在于：雖初步構(gòu)建了miR-21特異性報(bào)告基因成像體系，但僅進(jìn)行了契倫科夫光學(xué)成像以及γ放射性計(jì)數(shù)率的測定，及針對(duì)miR-21成像的特異性驗(yàn)證，未進(jìn)行射線信號(hào)的直接成像。后續(xù)研究中，將構(gòu)建原位荷瘤及轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型，并進(jìn)行活體PET/契倫科夫光學(xué)成像，評(píng)價(jià)該報(bào)告基因體系用于多模態(tài)定量動(dòng)態(tài)成像的性能。

綜上所述，本文構(gòu)建了一種用于對(duì)腫瘤內(nèi)miR-21進(jìn)行靶向契倫科夫光學(xué)成像的新型報(bào)告基因體系。該體系有望進(jìn)一步推廣至活體多模態(tài)成像應(yīng)用，為實(shí)時(shí)、定量表征腫瘤細(xì)胞的特定microRNA表達(dá)水平、分布及其動(dòng)力學(xué)特征提供了新的方法學(xué)思路，并為達(dá)成腫瘤的精準(zhǔn)診療探索了新的技術(shù)路徑。