彭　捷,饒　云,陸建華,吳昊澎,楊秀環(huán),屠偉峰

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科，廣東廣州　510010)

Tat-LK15運(yùn)載siRNA沉默RGC-5神經(jīng)細(xì)胞nNOS基因的實(shí)驗(yàn)研究

彭捷,饒?jiān)?陸建華,吳昊澎,楊秀環(huán),屠偉峰

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510010)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R329.25；R341.6；R342.2；R394.2；R441.1；R741.02

摘要：目的探討離體條件下細(xì)胞穿透肽Tat-LK15運(yùn)載小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)沉默RGC-5視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell line, RGC-5)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)基因的可行性，為在體條件下研究Tat-LK15運(yùn)載siRNA沉默nNOS表達(dá)治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。方法① 通過(guò)凝膠阻滯分析測(cè)定Tat-LK15與siRNA的最佳交聯(lián)比。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tat-LK15/ FAM-siRNA以最佳交聯(lián)比轉(zhuǎn)染RGC-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；不同劑量Tat-LK15(1、2.5、5、10和20 μg)孵育RGC-5細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。② 制備nNOS高表達(dá)的RGC-5細(xì)胞模型。③ 將RGC-5細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、Tat-S組(Tat-LK15運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)、Lipo-S組(LipofectamineTMRNAiMAX運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)及Tat-N組(Tat-LK15運(yùn)載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)，通過(guò)Q-PCR及Western blot檢測(cè)各組nNOS表達(dá)水平。 結(jié)果Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2 ∶1時(shí)可完全包裹siRNA，達(dá)到最佳交聯(lián)，此時(shí)其轉(zhuǎn)染效率為(84.4±3.9)%。當(dāng)Tat-LK15劑量為20 μg(6.1 μmol·L-1)時(shí)才出現(xiàn)一定細(xì)胞毒性，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%，P<0.05]。造模后RGC-5細(xì)胞nNOS表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Tat-S組與Lipo-S組相比無(wú)差異(P>0.05)。 結(jié)論Tat-LK15能高效轉(zhuǎn)染siRNA，細(xì)胞毒性低，離體條件下可有效運(yùn)載siRNA沉默nNOS的基因表達(dá)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿透肽；Tat；siRNA；基因治療；神經(jīng)型一氧化氮合酶；神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)是脊髓、大腦等神經(jīng)系統(tǒng)中催化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生重要的神經(jīng)介質(zhì)——一氧化氮(nitric oxide, NO)的關(guān)鍵酶，nNOS在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[1]。通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制nNOS的過(guò)度表達(dá)是治療神經(jīng)病理性疼痛的新途徑。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)本身易被核酸酶降解、穩(wěn)定性差、親水性強(qiáng)且?guī)ж?fù)電，不易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮作用。高效、安全siRNA遞送載體的缺乏嚴(yán)重限制了RNA干擾技術(shù)的臨床應(yīng)用。

細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一類由5~30個(gè)氨基酸組成的短肽，能將核酸片段、蛋白、多肽、噬菌體顆粒及磁性粒子等多種物質(zhì)以非受體依賴的方式導(dǎo)入胞內(nèi)，效率高、細(xì)胞毒性低，也不受細(xì)胞類型的限制[2]。CPPs與寡核苷酸形成的納米復(fù)合物穩(wěn)定性良好，在血清中不易被降解，轉(zhuǎn)染效率甚至優(yōu)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體[3]。目前CPPs已在基因生物治療、腫瘤靶向藥物開發(fā)等領(lǐng)域逐步展現(xiàn)出誘人的前景，受到廣泛關(guān)注[4]。

Tat(transactivator of transcription)是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子，是當(dāng)前最受矚目、研究最為深入的CPPs之一。Tat全長(zhǎng)86個(gè)氨基酸，第49-57位(RKKRRQRRR)9個(gè)氨基酸是其發(fā)揮穿膜功能的核心序列[5]。Saleh等[6]發(fā)現(xiàn)該核心序列與膜活化多肽LK15(KLLKLLLKLLLKLLK)融合形成的細(xì)胞穿膜肽Tat-LK15運(yùn)載siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力為單獨(dú)應(yīng)用Tat時(shí)的2倍。因此，Tat-LK15或許可以作為一種良好的siRNA運(yùn)載工具，明顯優(yōu)化RNA干擾技術(shù)在治療神經(jīng)病理性疼痛等方面的應(yīng)用。

本研究在建立nNOS高表達(dá)的RGC-5視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)模型的基礎(chǔ)上，探討Tat-LK15運(yùn)載siRNA沉默模型細(xì)胞nNOS基因表達(dá)的可行性，為后期在體應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制神經(jīng)系統(tǒng)nNOS過(guò)度表達(dá)來(lái)治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat.No.SH30022.01B)，DMEM-低糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat.No.SH30021.01B)，胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)，青、鏈霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)，F(xiàn)AM-siRNA(上海吉瑪)，nNOS/siRNA和NCsiRNA(Sigma，美國(guó))，Tat-LK15(廈門博欣生物)，LipofectamineTMRNAiMAX(invitrogen，13778075)，anti-nNOS(Abcam，ab76067)，Goat Anti-Rabbit IgG(Southern Biotech，4050-05)，倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)，倒置熒光顯微鏡(Leica，DMI6000B)，流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACS Calibur)，紫外分光光度計(jì)(艾本德，BioPhotometer plus)，SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen，15596-026)，PCR儀ABI PRISM?7500(ABI)，凝膠成像系統(tǒng)Doc Gel 2000型(BIO-RAD)。

1.1.2細(xì)胞株與分組大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5(廣州萊德爾生物)，制備高表達(dá)nNOS蛋白的RGC-5神經(jīng)細(xì)胞模型。隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(正常細(xì)胞)、模型組(nNOS高表達(dá))、Tat-S組(Tat-LK15運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)、Lipo-S組(Lipo運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)及Tat-N組(Tat-LK15運(yùn)載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)。

1.2方法

1.2.1siRNA序列與Tat-LK15nNOS雙鏈siRNA正義鏈：5′-CAAGUUCCGCCUCACGUAUdTdT-3′， 反義鏈：5′-AUACGUGAGGCGGAACUUGdTdT-3′；NCsiRNA正義鏈： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。Tat-LK15序列：RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLK

LLK，純度95%， 分子量：3 283.4 g·mol-1。

1.2.2凝膠阻滯測(cè)定Tat-LK15/siRNA最佳交聯(lián)比siRNA質(zhì)量恒定為100 ng，Tat-LK15和siRNA以質(zhì)量比為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1混合孵育20 min后上樣，20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，電壓1.8 V·cm-1，低溫電泳2 h。之后將凝膠在0.5 mg·L-1的EB溶液中染色45 min，觀察并拍照。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞RGC-5細(xì)胞使用DMEM-高糖培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清和1%青、鏈霉素)，置于含5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，取6孔板以細(xì)胞密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種，細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為30%~50%時(shí)，去完全培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。Opti-MEM培養(yǎng)基500 μL稀釋FAM-siRNA至終濃度50 nmol·L-1；Opti-MEM培養(yǎng)基500 μL稀釋Tat-LK15，Tat-LK15與FAM-siRNA質(zhì)量比為2 ∶1(最佳交聯(lián)比)。孵育20 min后加到相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板中，終培養(yǎng)基2 mL進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4 h后去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入完全培養(yǎng)基置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果并拍照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，并與LipofectamineTMRNAiMAX (Lipo)5 μL相比較。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使得其密度大約為每毫升1×106細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析(激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm)，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，所有步驟避光進(jìn)行。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率提前1 d取6孔板以細(xì)胞密度1×105/孔接種培養(yǎng)。取Tat-LK15 1、2.5、5、10和20 μg分別孵育細(xì)胞24 h，并與正常細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照。處理結(jié)束收集細(xì)胞，PBS重懸，細(xì)胞密度約每毫升1×106個(gè)細(xì)胞。取0.5 mL離心去上清，加入500 μL 1×結(jié)合緩沖液混勻。再依次加入1.25 μL Annexin V-FITC，10 μL PI輕輕混勻；室溫(18~24)℃避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)檢測(cè)。

1.2.6制備高表達(dá)nNOS的細(xì)胞模型以缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)和高鹽(濃度145 mmol·L-1)的處理方式制備nNOS高表達(dá)的細(xì)胞模型[7]。將厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣劑1包和厭氧指示劑放入方形培養(yǎng)罐制造缺氧模型，同時(shí)放入細(xì)胞培養(yǎng)板，以37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)指示劑在氧含量低于0.1%時(shí)(呈粉紅色)開始計(jì)時(shí)，24 h后缺氧結(jié)束，置入普通培養(yǎng)箱復(fù)氧48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.7Tat-LK15/siRNA對(duì)nNOS的沉默效率造模成功后取5組細(xì)胞，siRNA終濃度為50 nmol·L-1，TAT-LK15與siRNA交聯(lián)比為2 ∶1 (μg/μg)，Lipo 5 mL。在造模缺氧24 h后取細(xì)胞板置于普通培養(yǎng)箱開始復(fù)氧，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，復(fù)氧48 h(即轉(zhuǎn)染48 h)后收集細(xì)胞檢測(cè)nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8Q-PCR檢測(cè)nNOS mRNA收集細(xì)胞用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。nNOS上游引物：5′-GGACGCTGGTGTATTCATCA-3′，下游引物：5′- AAGGCGATGGACTCAGATCT-3′ 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度120 bp；β-actin上游引物：5′- AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′ 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150 bp。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 熱啟動(dòng)2 min，95 ℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入循環(huán)； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸讀板32 s，共50個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以SDS v1.4軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.9Western blot檢測(cè)nNOS蛋白收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將調(diào)整的樣品和上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸5 min蛋白變性；按每泳道總蛋白50 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度6%，濃縮膠濃度5%)，待溴酚藍(lán)電泳至接近分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，與稀釋的anti-nNOS一抗(1 ∶1 000)4℃過(guò)夜，洗滌后再加入Goat anti-rabbit IgG二抗(1 ∶20 000)中37 ℃孵育1 h，漂洗后ECL顯色，暗室進(jìn)行曝光、顯影和定影，經(jīng)掃描后使用Gel-Pro analyzer分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算nNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1Tat-LK15與siRNA最佳交聯(lián)比非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，隨著Tat-LK15劑量增加，核酸條帶亮度逐漸變淡，當(dāng)質(zhì)量比為2 ∶1時(shí)電泳條帶完全消失。說(shuō)明在質(zhì)量比2 ∶1(μg/μg)時(shí)，Tat-LK15已能充分交聯(lián)siRNA(Fig 1)。

Fig 1Complex formation of Tat-LK15/siRNA electrophoresis

0: free siRNA; 1, 2, 3, 4, 5 respectively as complex formation Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 1 ∶3, 1 ∶2, 1 ∶1, 2 ∶1 and 3 ∶1 (μg/μg).

2.2最佳交聯(lián)比時(shí)Tat-LK15/siRNA的轉(zhuǎn)染效率Tat-LK15與FAM-siRNA (50 nmol·L-1) 質(zhì)量比為2 ∶1 (μg/μg) 時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率為(84.4±3.9)%，低于Lipo 5 μl的 (95.6±2.4)%(P<0.05)，見Fig 2、3。

Fig 2Transfection efficiency examined by flow cytometry

A:Blank group;B: Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 2 ∶1(μg/μg);C:Lipo 5 μL.

Fig 3　Transfection of RGC-5 cells transfected with FAM-siRNA (Inverted fluorescence microscope×100)

*P<0.05vsblank group.

2.3Tat-LK15作用于細(xì)胞的凋亡率Tat-LK15劑量增加到20 μg (6.1 μmol·L-1) 時(shí)，才開始出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%，P<0.05]。說(shuō)明其細(xì)胞毒性低，具有良好的生物安全性(Tab 1)。

2.4制備高表達(dá)nNOS的細(xì)胞模型經(jīng)過(guò)缺氧缺糖高鹽處理后RGC-5細(xì)胞nNOS蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；單純OGD處理nNOS表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。因此，缺氧缺糖高鹽處理可以得到理想的nNOS高表達(dá)細(xì)胞模型(Fig 4、5)。

2.5Tat-LK15/siRNA的沉默效率與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA表達(dá)降低63.1%，蛋白表達(dá)降低62.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Tat-N組與模型組，Tat-S組與Lipo-S組nNOSmRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)差異(P>0.05)，見Fig 6、7、8。

3討論

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)受損或功能障礙所導(dǎo)致的疼痛，是目前亟待解決的臨床問(wèn)題。nNOS在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同水平的過(guò)度表達(dá)是神經(jīng)病理性疼痛形成、維持和發(fā)展的重要機(jī)制[8]。采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默過(guò)度表達(dá)的nNOS則是治療神經(jīng)病理性疼痛的新思路。

Fig 4Western blot of nNOS expression in RGC-5

cells exposed to OGD

Fig 5Relative expression of nNOS protein in

RGC-5 cells exposed to OGD

C:Normal cells;OGD:Exposed to oxygen-glucose deprivation; OGD+high NaCl: Exposed to oxygen-glucose deprivation and 145 mmol·L-1NaCl,*P<0.05vsC group.

Fig 6Relative expression of nNOS mRNA in RGC-5 cells interfered by Tat-LK15/siRNA

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

Fig 7Western blot of nNOS expression in RGC-5 cells in groups

Fig 8Western blot of quantification of Tat-LK15

mediated nNOS knockdown in RGC-5 cells

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

要將siRNA成功導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮干擾效應(yīng)，安全高效的基因載體是關(guān)鍵。常用的siRNA載體包括病毒載體系統(tǒng)和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等，前者可能導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，并有潛在的病毒體內(nèi)復(fù)制擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[9]；后者具有一定細(xì)胞毒性，干擾細(xì)胞代謝，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在體使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體可誘發(fā)肺部炎癥，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重肺損傷[10]。而CPPs具轉(zhuǎn)染效率高、無(wú)毒、無(wú)免疫性的特點(diǎn)，可將包括siRNA在內(nèi)的多種物質(zhì)以非受體依賴、非經(jīng)典內(nèi)吞的方式直接導(dǎo)入胞內(nèi)，且不受細(xì)胞類型的限制。有研究證實(shí)，CPPs介導(dǎo)的寡聚核苷(oligonucleotides，ONs)可有效地抑制目的基因的表達(dá)，且不會(huì)激發(fā)體內(nèi)的免疫反應(yīng)，彰顯了CPPs-Ons復(fù)合物在基因治療領(lǐng)域的希望和巨大潛力[11]。

HIV-Tat是現(xiàn)今研究最廣泛最深入的細(xì)胞穿透肽之一，Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域已被廣泛用于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究，如化學(xué)合成Tat融合蛋白，或構(gòu)建包含Tat和目的蛋白基因的質(zhì)粒載體產(chǎn)生Tat融合蛋白，導(dǎo)入宿主細(xì)胞或用于在體研究等[12]。值得注意的是，目前隨著Tat介導(dǎo)核酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究逐步深入。Park等[13]發(fā)現(xiàn)Tat能夠攜帶質(zhì)粒DNA穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，并對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。Hyunmin 提出Tat-PAMAM融合蛋白可有效提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，成功用于介導(dǎo)抗體和siRNA的傳送[14]。Eguchi等[3]通過(guò)結(jié)合一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合域(double strand RNA Binding Domain，DRBD)修飾的Tat蛋白結(jié)構(gòu)域(即Tat-DRBD融合蛋白)可以包裹siRNA上的負(fù)電荷骨架，防止其沉淀聚集，從而改善Tat對(duì)siRNA的轉(zhuǎn)染效率，甚至優(yōu)于脂質(zhì)體。Alain Pluen等證實(shí)Tat-LK15運(yùn)載siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力為單獨(dú)應(yīng)用Tat時(shí)的2倍。Arthanari等[15]則指出膜活化多肽LK15修飾的Tat(Tat-LK15)可高效地介導(dǎo)基因的傳遞，而細(xì)胞毒性在其濃度10 μmol·L-1時(shí)，即使用劑量的50倍才會(huì)開始出現(xiàn)。綜上可見，Tat相關(guān)載體核酸轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低，在核酸轉(zhuǎn)運(yùn)方面可能具有良好的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2 ∶1時(shí)可完全包裹siRNA。Tat-LK15/siRNA在此交聯(lián)比時(shí)轉(zhuǎn)染RGC-5細(xì)胞的效率可達(dá)(84.4±3.9)%，低于Lipo的(95.6±2.4)%。Tat-LK15孵育RGC-5神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，增加Tat-LK15的劑量并沒(méi)有引起明顯的細(xì)胞毒性，僅當(dāng)劑量增至實(shí)驗(yàn)劑量的10倍(20 μg)時(shí)才開始出現(xiàn)輕微的影響。構(gòu)建nNOS高表達(dá)的細(xì)胞模型后，Tat-LK15/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞，其nNOS mRNA表達(dá)降低63.1%，蛋白表達(dá)降低62.9%，效果與Lipo相當(dāng)，甚至略優(yōu)于Lipo。由此可見，盡管Tat-LK15的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率略低于Lipo，但其細(xì)胞毒性極低，安全優(yōu)勢(shì)突出，且最終的轉(zhuǎn)染效果并不亞于Lipo，可以作為運(yùn)載siRNA干擾神經(jīng)細(xì)胞nNOS表達(dá)的有效工具。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為后期探討Tat-LK15在體條件下運(yùn)載siRNA干擾nNOS過(guò)度表達(dá)治療神經(jīng)病理性疼痛打下提供了理論依據(jù)。

綜上所述，Tat相關(guān)載體作為最有應(yīng)用前景的CPPs，在核酸轉(zhuǎn)運(yùn)等方面已經(jīng)得到廣泛的研究和關(guān)注，各類研究成果已逐步向臨床應(yīng)用等方面轉(zhuǎn)化，相信經(jīng)過(guò)不懈的努力，Tat相關(guān)載體做為有效的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)手段，將在疾病的基因治療等領(lǐng)域發(fā)揮不可低估的作用。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026.html

Delivery of therapeutic siRNA by Tat-LK15 targeting

nNOS fusion gene in RGC-5 cells

PENG Jie, RAO Yun, LU Jian-hua, WU Hao-peng, YANG Xiu-huan, TU Wei-feng

(DeptofAnesthesiology,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Abstract：AimTo investigate the potential application of a non-viral gene carrier Tat-LK15 for delivering siRNA targeting nNOS in vitro, which provides evidence of Tat-LK15 mediating siRNA targeting nNOS in vivo for treatment of neuropathic pain. Methods1. Tat-LK15 was mixed with siRNA, then the mixture was analyzed the best ratio by Gel retardation. The transfection efficiency of FAM-siRNA mediated by Tat-LK15 on RGC-5 cells was examined by Flow Cytometry. The apoptosis ratio of RGC-5 was identified by Flow Cytometry 24h after treated with the different doses of Tat-LK15 (1, 2.5, 5, 10 and 20 μg). 2. The model of RGC-5 cell overexpression of nNOS protein was prepared. 3. RGC-5 cells were randomly divided into 5 groups: control group,model group, Tat-S group (Tat-LK15 mediate nNOS/siRNA transfection model cell), Lipo-S group (LipofectamineTMRNAiMAX mediate nNOS/siRNA transfection model cell) and Tat-N group (Tat-LK15 mediate NCsiRNA transfection model cell). Real-time Quantitative polymerase chain reaction(Q-PCR) and Western blot were used to evaluate nNOS expression level assay. ResultsIt indicated that the Tat-LK15/siRNA complex completely formed at the weight ratio of 2 ∶1 (μg/μg), and the transfection efficiency was (84.4±3.9)%. It caused cotytoxicity when Tat-LK15 dose was 20 μg (6.1 μmol·L-1), and the apoptosis rate more than control group[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%, P<0.05]. The nNOS protein level of RGC-5 cells was significantly elevated after modeling. Compared with that of model group, Tat-LK15/siRNA efficiently inhibited the expression of nNOS at transcriptional level or protein leve1 of Tat-S group (P<0.05), and there was no significant difference of the efficiency inhibited between Tat-S group and Lipo-S group. ConclusionsTat-LK15’ advantage is with high efficiency, low cytotoxicity. The Tat-LK15 can deliver siRNA targeting nNOS in vitro efficiently and safely.

Key words：cell penetrating peptides (CPPs); Tat; siRNA; gene therapy; nNOS; neuropathic pain

通訊作者陸建華(1966-)，男，博士后，主任醫(yī)師，，研究方向：急慢性疼痛基因治療，Tel：020-88653504，E-mail: lujianh@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：彭捷(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：急慢性疼痛的基因治療，E-mail: excelsiorscholar@163.com;

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81100817,81371233)

收稿日期:2014-10-21,修回日期:2014-11-22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0278-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026