周幸芝，段杉，孟曉華，3，梁少雅，4，呂建秋，蔣艷萍

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

2(江門市地爾漢宇電器股份有限公司，廣東江門，529040)3(鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁，458030)

4(平安數(shù)據(jù)科技(深圳)有限公司，廣東深圳，518031)5(廣東省科技管理與規(guī)劃研究院同，廣東 廣州，510642)

在高于冰點的冷藏溫度下，魚片的保質(zhì)期仍較短，為延長魚片的保質(zhì)期，通常是添加防腐劑，但合成防腐劑一般不易被消費者接受，而天然防腐劑往往抑菌譜窄、保鮮效果較差、價格高，而且國家《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中批準使用的天然防腐劑種類十分有限，難以滿足實際生產(chǎn)需要。

近年興起的生物保鮮技術(shù)則提供了一種保藏魚片的新方法，該方法利用微生物之間的拮抗或競爭作用，在接近新鮮狀態(tài)下保藏食品［1-4］。

Nychas等［5］和 Stanbridge 等［6］均認為，在有氧冷藏條件下，肉類食品的主要腐敗微生物假單胞菌首先利用葡萄糖，當環(huán)境中的葡萄糖消耗完畢后，假單胞菌才開始分解氨基酸，并產(chǎn)生胺、氨、吲哚、硫化氫等各種腐敗產(chǎn)物。魚片與哺乳動物肉類類似，蛋白質(zhì)含量高，碳水化合物含量很低，如果在基本不改變魚片風(fēng)味等感官質(zhì)量的前提下，適當添加葡萄糖等碳水化合物，則微生物對蛋白質(zhì)的分解可能減少，有望在一定程度上減少腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生。

乳酸菌的生長和代謝一般需要葡萄糖等碳源，在用乳酸菌保鮮魚片的過程中，適當添加葡萄糖是否可以增強乳酸菌的保鮮作用，迄今未見報道。本文針對乳酸菌及葡萄糖對魚片中細菌群落和TVBN生成量的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料

羅非魚片:由茂名市海名威水產(chǎn)科技有限公司提供。

乳酸菌:Lactobacillus acidophilus CICC6074，Lactobacillus plantarum CICC6009，Lactobacillus plantarum CICC6234，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;Lactobacillus acidophilus GIM1.208，Lactobacillus bulgavicus GIM1.189，Lactobacillus helveticus GIM1.157，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus GIM1.204，購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心;Lactobacillus acidophilus SW01，Lactobacillus sp.SW02，Lactobacillus sp.SW03，為本課題組從蝦頭蝦殼中篩選得到。

細菌基因組DNA快速提取試劑盒，廣州東盛生物科技公司;DNA Marker DL2000，NEW GENE BIOTECHNOLOGY;Goldview染料(含量≥95%)，CAT;溴化乙錠(EB)應(yīng)用液、6×上樣緩沖液，WOSLEN;2×GoTaq Green Master Mix，Promega;引物，上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚片的處理

分別配制1.5%葡萄糖溶液、3×108CFU/mL的嗜酸乳桿菌CICC6074懸液2種(即以無菌蒸餾水配制的懸液以及以1.5%葡萄糖溶液配制的懸液)，將羅非魚片分別浸泡在上述各溶液中30 min，以浸泡蒸餾水的羅非魚片為對照，瀝干3 min，然后以塑料膜覆蓋，放于4℃冰箱中，每隔3 d取樣分析。

CICC6074懸液的制備方法:將活化后的嗜酸乳桿菌CICC6074接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h，無菌條件下取1 mL菌懸液測定乳酸菌數(shù);同時將剩余菌懸液離心，棄清液，得菌體沉淀，再用無菌水洗沉淀2次，離心收集菌體，將菌體加無菌水稀釋至濃度為3×108CFU/mL懸液。

1.2.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)的測定

按照GB/T 5009.44-2003微量擴散法測定［7］，以每100 g樣品中所含氮質(zhì)量(mg)表示。

1.2.3 細菌總數(shù)的測定

按GB 4789.2-2010方法測定。

1.2.4 pH值的測定

使用pH計測定。

1.2.5 葡萄糖的測定

采用DNS-二硝基水楊酸法測定。

1.2.6 細菌DNA的提取

取10 g魚肉于盛有玻璃珠及90 mL生理鹽水無菌錐形瓶中，于搖床上振蕩后靜置5 min，取20 mL上清液，然后離心保留沉淀的菌體，按試劑盒說明提取細菌DNA。將所提DNA溶于60 μL TE洗脫液中，取4 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 細菌DNA的16S rDNA的V3可變區(qū)的PCR擴增

采用巢氏PCR，第1輪采用引物8f/798r擴增約800 bp的細菌16S rDNA片段［8］。PCR反應(yīng)體系(25 μL):GoTaq Green Master Mix(2 × )12.5 μL，引物各1 μL(10 μmol/L)，細菌 DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性1 min，58 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個循環(huán);最后72℃再延伸2 min。取4 μL PCR產(chǎn)物利用含Goldview染料的1%瓊脂糖電泳檢測產(chǎn)量及特異性，其余用于第2輪PCR反應(yīng)。

第2輪PCR以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，采用引物GC338f/518r，對細菌16SrDNA的V3區(qū)片段進行touch down PCR擴增。反應(yīng)體系(50 μL):GoTaq Green Master Mix(2 × )25 μL，引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA 模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 擴增程序:94℃ 預(yù)變性5 min，然后采用touch down PCR程序，20個循環(huán)(94℃變性1 min;退火溫度從65～55℃，退火30 s;72℃延伸3 min)，再于恒定的退火溫度下進行10個循環(huán)(94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸3 min)，最后72℃再延伸10 min［9-10］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃凍存。

擴增所用引物序列見表1。

表1 擴增所用引物Table 1 The primers used in this research

1.2.8 PCR產(chǎn)物的DGGE分析

參照Muyzer等［10］方法，聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量濃度為80 g/L(丙烯酰胺與甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為37.5∶1)，變性劑梯度為40% ～60%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，在1×TAE緩沖液中，60℃恒溫條件下，150 V電壓電泳5 h。電泳結(jié)束后，將DGGE膠片用1×TAE(含0.5 mg/L EB)染色30 min。棄去染色液，再用 ddH2O漂洗10 min。染色后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.9 DGGE條帶的切割、重擴增及PCR產(chǎn)物純化

參照Toffin等［11］方法，切下 DGGE電泳膠片中的主要條帶，壓碎并以30 μL ddH2O浸泡，4℃放置過夜。取上述浸泡液10 μL作DNA模板，以338f(無GC夾)/518r為引物，采用前述PCR條件擴增。取4 μL PCR產(chǎn)物，瓊脂糖電泳檢查產(chǎn)量及特異性。PCR產(chǎn)物的純化采用割膠純化法。

1.2.10 DGGE條帶的克隆、測序

DNA測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。將割膠純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細胞，對陽性克隆株進行測序。測序獲得細菌16S rDNA V3區(qū)片段序列后，用BLAST命令與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，找出相似度最高的序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 用于魚片保鮮的乳酸菌菌種的篩選

由表2可以看出，經(jīng)以不同乳酸菌處理的羅非魚片在冷藏過程中其TVBN值均明顯比對照魚片低，說明上述乳酸菌對魚片均有一定的保鮮效果。其中CICC 6074和GIM1.208的效果接近，且優(yōu)于其他乳酸菌，但冷藏9 d后的感官評定結(jié)果表明，經(jīng)CICC 6074處理的魚片的感官質(zhì)量略優(yōu)于經(jīng)GIM1.208處理的魚片，因此，選擇CICC 6074處理魚片進行以下研究。

表2 用不同乳酸菌處理的羅非魚片在4℃冷藏過程中的TVBN值變化Table 2 Changes of TVBN values of tilapia fillets treated with various lactic acid bacteria during 4℃cold storage

2.2 添加葡萄糖對冷藏羅非魚片的TVBN值和菌落數(shù)的影響

感官評定結(jié)果表明，經(jīng)葡萄糖處理過的魚片在外觀、風(fēng)味、口感方面基本未變。添加葡萄糖的魚片以及未添加葡萄糖的對照魚片在4℃冷藏條件下其各種指標變化如圖1和圖2所示。圖1顯示，冷藏6 d時對照魚片的TVBN值已達到22 mg/kg，超過國家限量標準200 mg/kg［12］;而添加葡萄糖的羅非魚片其TVBN值僅為91 mg/kg，大大低于對照魚片;冷藏至9 d時，上述二種魚片的TVBN值較接近且均已很高。但觀察圖2中葡萄糖含量的變化，就可以發(fā)現(xiàn)冷藏6 d以內(nèi)，添加葡萄糖的魚片中葡萄糖的含量一直顯著高于對照魚片，但至第6天時其含量已由最初的0.75%下降至0.09%，已基本被消耗完畢，所以在6～9 d的冷藏過程中已無葡萄糖的影響。總結(jié)上述現(xiàn)象，可以發(fā)現(xiàn)魚片中葡萄糖含量與TVBN值之間有一定的規(guī)律可循，即葡萄糖含量較高時TVBN值較低，反之則明顯增高。Koutsoumanis等［13］也發(fā)現(xiàn)當肉類中葡萄糖濃度下降到很低時腐敗現(xiàn)象才變得明顯。

圖1 添加葡萄糖的羅非魚片在冷藏過程中的TVBN和菌落數(shù)的變化Fig.1 Changes of TVBN and bacterial population of the fillets added with glucose during cold storage

從圖1還可以看到，冷藏至第3天時，添加葡萄糖的魚片的菌落數(shù)顯著高于對照魚片的菌落數(shù)(P＜0.05)，冷藏6 d以后，二者菌落數(shù)接近，這說明添加葡萄糖后魚片上的細菌更快進入對數(shù)期，導(dǎo)致冷藏初期添加葡萄糖的魚片上細菌數(shù)較多，但添加葡萄糖基本不影響魚片上最終的細菌數(shù)量。Lambropoulou等［14］也發(fā)現(xiàn)在碎牛肉中添加葡萄糖基本不改變菌相和細菌數(shù)量。值得注意是，盡管冷藏至3天時，添加葡萄糖的魚片的菌落數(shù)高于對照魚片的菌落數(shù)，但TVBN值則相反，仍然是添加葡萄糖的魚片TVBN值較低，這是因為添加的葡萄糖滿足了魚片中的細菌對碳源和能源的基本需求，魚片中的蛋白質(zhì)不再作為碳源和能源，而只是作為氮源被細菌分解利用，由于被細菌分解的蛋白質(zhì)大大減少，所以TVBN等蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的腐敗產(chǎn)物也大大減少。

雖然圖2顯示冷藏中添加葡萄糖的魚片與對照魚片的pH值存在一定差別，但二種魚片的pH值始終維持在6.08～7.09之間，二者之間最大的差距出現(xiàn)在冷藏6 d時，分別為6.08和6.79，由常識可知，在此pH范圍內(nèi)，普通細菌的生長和代謝不可能受到比較明顯的影響，也不可能造成冷藏6 d以內(nèi)TVBN值的巨大差別。

圖2 添加葡萄糖的羅非魚片在冷藏過程中的葡萄糖和pH含量的變化Fig.2 Changes of glucose content and pH of the fillets added with glucose during cold storage

2.3 嗜酸乳桿菌CICC 6074對冷藏羅非魚片的TVBN值的影響

從圖3可以看到，無論是否添加葡萄糖，嗜酸乳桿菌CICC 6074懸液浸泡過的魚片其TVBN值均顯著低于對照魚片，對照魚片冷藏6 d時TVBN值已達到 221 mg/kg，超過國家限量標準200 mg/kg［12］;而經(jīng)CICC 6074懸液浸泡的添加及不添加葡萄糖的二種魚片的TVBN值分別僅為44、65 mg/kg，與對照魚片的差異極顯著(P＜0.01)，直至冷藏12 d時，此二種魚片的TVBN值才超過國家限量標準。Ndaw等［15］以乳酸菌和葡萄糖處理沙丁魚片，也發(fā)現(xiàn)TVBN顯著降低。從圖3還可以看到經(jīng)CICC 6074懸液浸泡并且添加葡萄糖的魚片的TVBN值始終略低于僅經(jīng)CICC 6074懸液浸泡的魚片，但方差分析顯示在冷藏的前9 d二者不存在顯著性差異(P＞0.05)，9 d后差異顯著(P＜0.05)，因此，以CICC 6074和葡萄糖共同處理魚片究竟是否會進一步降低TVBN值需進一步研究確定。圖4顯示CICC 6074懸液浸泡過的添加及不添加葡萄糖的二種魚片冷藏過程中的pH值變化不存在顯著性差異(P＞0.05)，但與對照魚片的pH值變化存在顯著性差異(P＜0.05)。羅非魚片中添加了乳酸菌，利用菌落計數(shù)的方法無法得知腐敗菌的數(shù)量，因此本文沒有進一步研究嗜酸乳桿菌CICC 6074對羅非魚片上細菌菌落數(shù)的影響。

圖3 嗜酸乳桿菌CICC 6074處理的羅非魚片在冷藏過程中TVBN和葡萄糖含量的變化Fig.3 Changes of TVBN and glucose content of the fillets treated with L.acidophilus CICC6074 during cold storage

圖4 嗜酸乳桿菌CICC 6074處理的羅非魚片在冷藏過程中pH的變化Fig.4 Changes of pH of the fillets treated with L.acidophilus CICC6074 during cold storage

2.4 嗜酸乳桿菌CICC6074對冷藏羅非魚片上細菌生長的影響

本文進一步采用PCR-DGGE的方法分析了嗜酸乳桿菌CICC6074對冷藏羅非魚片上細菌生長的影響。經(jīng)PCR擴增的細菌16S rDNA經(jīng)DGGE電泳，電泳圖譜如圖5所示。

切割圖5中各電泳條帶并經(jīng)測序后與GeneBank中序列比對，鑒定結(jié)果如表3所示。在冷藏初期對照組魚片上主要有少量希瓦氏菌和假單胞菌，而經(jīng)過CICC6074處理的魚片上嗜酸乳桿菌占絕對優(yōu)勢。在冷藏過程中，假單胞菌數(shù)量逐漸增多，對照組魚片在冷藏3 d后其假單胞菌的數(shù)量已明顯增加，6 d后則基本達到最高峰，直至結(jié)束其數(shù)量基本保持恒定;而經(jīng)過CICC6074處理的魚片冷藏3 d后假單胞菌數(shù)量基本未增加，冷藏6 d后才明顯增加。此外，隨著冷藏時間延長，檢測到的細菌種類也有所增加，至冷藏6 d后逐漸出現(xiàn)嗜冷桿菌、黃桿菌以及幾種未鑒定的細菌。嗜酸乳桿菌CICC6074的數(shù)量在冷藏3 d時略有增加，冷藏6 d后有所下降，9 d后消失，此現(xiàn)象表明在冷藏初期魚片吸附的大量嗜酸乳桿菌CICC6074暫時占據(jù)了優(yōu)勢地位，并憑借此數(shù)量優(yōu)勢抑制了假單胞菌等腐敗細菌的生長和代謝，但CICC6074在冷藏羅非魚片上生長較慢，最終無法同假單胞菌等腐敗菌競爭，導(dǎo)致魚片腐敗。

圖5 羅非魚片上細菌16SrDNA的DGGE電泳圖Fig.5 DGGE pattern of 16SrDNA of bacteria in tilapia fillets(the lanes were the same as those in Fig 5)

表3 冷藏羅非魚片中細菌16S rDNA序列DGGE電泳條帶的分離鑒定Table 3 Blast results of the 16S rDNA sequences from the DGGE bands of the bacteria in cold stored tilapia fillets

現(xiàn)已確認，假單胞菌為冷藏魚類的特定腐敗菌［16-17］，抑制假單胞菌的生長將有效延緩魚類的腐敗速度。本文以嗜酸乳桿菌處理羅非魚片后顯著延緩了假單胞菌等腐敗菌的生長，其原因可能包括嗜酸乳桿菌占據(jù)了大量生態(tài)位，或者產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物對假單胞菌產(chǎn)生拮抗作用。CICC6074不會大量增殖，從而對魚片原有感官性狀的影響較小，這與感官評定的結(jié)果一致;此外，嗜酸乳桿菌為益生菌，對人體無任何毒副作用，不會造成新的食品安全問題。這些說明將嗜酸乳桿菌CICC6074用于羅非魚片保鮮是可行的。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，以1.5%葡萄糖溶液和嗜酸乳桿菌CICC6074處理羅非魚片，魚片的感官性狀的基本不變。葡萄糖可以有效降低魚片 TVBN值;CICC6074可有效抑制假單胞菌等腐敗菌的生長，使冷藏羅非魚片的保質(zhì)期延長至接近12 d。

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