湯衛(wèi)華，王立暉，殷海松，孫勇民

(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津，300350)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是以高濃度乳糖做底物，在具有半乳精基轉(zhuǎn)移活性的β-半乳糖苷酶(EC3.1.3)的作用下，將半乳糖轉(zhuǎn)移到乳糖的半乳糖基上，低聚半乳糖是在乳糖中的半乳糖基一側(cè)結(jié)合1～4個(gè)分子的半乳糖的混合物。它是功能性低聚糖的一種，在母乳中的含量非常豐富，因此低聚半乳糖作為雙歧桿菌的增殖因子引起人們的關(guān)注［1-2］。

目前低聚半乳糖的制備方法主要有天然原料提取、天然多糖酸解、化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法，其中酶法具有催化效率高、能耗低、污染低等優(yōu)點(diǎn)，是低聚半乳糖生產(chǎn)的主要方法［3］。酶法生產(chǎn)包括直接酶法和固定化酶法兩種，盡管直接酶法水解乳糖的工藝技術(shù)比較簡(jiǎn)單且成熟，但商品化β-半乳糖苷酶存在價(jià)格昂貴，添加量偏大且不利于產(chǎn)品的分離純化等缺點(diǎn)，因此很多研究者進(jìn)行固定化β-半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖的探索和研究。

殼聚糖是從蝦、蟹等甲殼類動(dòng)物的外殼中提取的一種氨基多糖，來(lái)源豐富，具有生物相容、生物降解、無(wú)毒、抗菌、螯合重金屬離子、對(duì)蛋白質(zhì)有高度親和等特點(diǎn)，是一種非常好的固定化載體［4］。很多研究人員［5-7］都進(jìn)行了殼聚糖固定化β-半乳糖苷酶的研究，取得了較好的固定化效果。殼聚糖因其來(lái)源不同，制備工藝不同，分子質(zhì)量變化較大，從幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等，因此對(duì)固定化載體成球性影響較大。本文從殼聚糖載體和固定化條件兩個(gè)方面綜合研究固定化β-半乳糖苷酶的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-半乳糖苷酶(米曲霉來(lái)源，13.4 U/mg，Sigma公司)，分子質(zhì)量分別為5 ×104、10 ×104、20 ×104、30×104、50×104的殼聚糖(脫乙酰度≥90%，深圳市中發(fā)源生物科技有限公司)，乳糖(化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，戊二醛(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鄰硝基苯酚 β-D-半乳糖苷(oNPG，Sigma公司)，其他試劑均為分析純。

紫外可見分光光度計(jì)UV-5500(PC)，上海元析儀器有限公司;恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱HNY2012C，上海百典儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-1)，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖微球制備條件的確定

1.2.1.1 殼聚糖分子質(zhì)量的確定［8］

分別稱取1.0 g不同分子質(zhì)量(5×104、10×104、20×104、30 ×104、50 ×104)的殼聚糖，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液溶解為4%的殼聚糖溶液，真空脫泡后加入注射器中，均勻滴入4 mol/L NaOH溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間后，取出用蒸餾水充分洗滌浸泡至中性，肉眼觀察殼聚糖的成球效果。

1.2.1.2 殼聚糖濃度的確定

稱取一定質(zhì)量的殼聚糖(分子質(zhì)量為30×104)，溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液中，形成濃度為1%、2%、4%、6%的殼聚糖，真空脫泡后加入注射器中，均勻滴入4 mol/L NaOH溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間后，取出用蒸餾水充分洗滌浸泡至中性，肉眼觀察殼聚糖的成球效果。

1.2.2 固定化條件的確定

1.2.2.1 戊二醛濃度的選擇

分別取1.0 g殼聚糖微球5份，分別加入質(zhì)量濃度為1、5、10、15、20 g/L 的戊二醛5 mL，在30 ℃下120 r/min振蕩反應(yīng)2h后，磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)清洗多余的戊二醛。然后加入1 mg/mL的 β-半乳糖苷酶液2 mL，4℃冰箱過(guò)夜，再用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)清洗未交聯(lián)的酶，即制備得到固定化酶，并測(cè)定固定化酶的活力和計(jì)算活力回收率。

1.2.2.2 戊二醛交聯(lián)時(shí)間的選擇

分別取1.0 g殼聚糖微球5份，加入質(zhì)量濃度為10 g/L的戊二醛5 mL，30℃，120 r/min下分別振蕩反應(yīng) 0.5、1、2、4 和 6 h，磷酸緩沖液(pH6.0)清洗多余的戊二醛。然后加入1 mg/mL的β-半乳糖苷酶液2 mL，即制備得到固定化酶，并測(cè)定固定化酶的活力和計(jì)算活力回收率。

1.2.2.3 酶濃度的選擇

分別稱取1.0 g殼聚糖微球5份，加入相同濃度和體積的戊二醛，在30℃，120 r/min下分別振蕩反應(yīng)相同的時(shí)間后，磷酸鹽緩沖液(pH6.0)清洗多余的戊二醛。再分別加入0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL酶液2 mL，4℃冰箱過(guò)夜，用緩沖液清洗未交聯(lián)的酶，測(cè)定固定化酶的活力和計(jì)算活力回收率。

1.2.2.4 酶固定化時(shí)間的確定

分別稱取1.0 g殼聚糖微球7份，加入相同體積和濃度的戊二醛，在30℃，120 r/min下振蕩反應(yīng)一段時(shí)間后，磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)清洗多余的戊二醛。加入相同濃度和體積的酶液，4℃冰箱固定化時(shí)間分別為 2、4、6、8、10、12、14 h，再用緩沖液清洗未交聯(lián)的酶，測(cè)定固定化酶的活力和計(jì)算活力回收率。

1.2.3 β-半乳糖苷酶活力測(cè)定［9］

游離酶液1 mL或固定化酶1 g加入9 mL 2 mmol/L oNPG(pH 5.5，0.1 mol/L醋酸緩沖液配制)，40℃反應(yīng)10 min，取混合液1 ml，再加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，離心，上清液測(cè)OD420?；盍挝灰?guī)定:以1 min催化oNPG生成1 μmol鄰硝基苯酚的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體的確定

2.1.1 殼聚糖分子質(zhì)量的確定

分別考察不同分子質(zhì)量的殼聚糖(5×104、10×104、20 ×104、30 ×104、50 ×104)對(duì)成球效果的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 固定化載體殼聚糖分子質(zhì)量的確定Table 1 Determinationof the molecular weight of chitosan

由表1可知，不同分子質(zhì)量的殼聚糖成球效果存在差異，殼聚糖分子質(zhì)量為3×105時(shí)，殼聚糖微球成球效果最好，同時(shí)具有較好的機(jī)械強(qiáng)度。當(dāng)殼聚糖分子質(zhì)量大于3×105時(shí)，制成溶液黏度大，不易成球且機(jī)械強(qiáng)度差，使用效果不好。當(dāng)殼聚糖分子質(zhì)量小于3×105時(shí)，由于殼聚糖分子質(zhì)量過(guò)小，制成溶液黏度過(guò)低，殼聚糖液滴在NaOH溶液中不能形成固定化膜或形成的固定化膜強(qiáng)度不夠，不易形成球形載體，這與李鴻玉的結(jié)論是相似的［10］。因此選取分子質(zhì)量為3×105的殼聚糖作為酶固定化載體。

2.1.2 殼聚糖濃度的確定

殼聚糖濃度大小會(huì)影響溶液的密度和黏度，因此稱取一定質(zhì)量的殼聚糖(分子質(zhì)量為3×105)，溶解于醋酸溶液中，形成濃度為1%、2%、4%和6%的殼聚糖，探討不同濃度的殼聚糖溶液對(duì)殼聚糖成球性的影響，結(jié)果見表2。

表2 固定化載體殼聚糖濃度的確定Table 2 Determination of the concentration of chitosan

結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖濃度為1%時(shí)，因其濃度太低，制得的殼聚糖溶液黏度太低，不易成球。當(dāng)殼聚糖濃度繼續(xù)增加，成球效果和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)一步提高，酶活力和酶活力回收率均達(dá)到較好的效果。殼聚糖的濃度增至6%時(shí)，殼聚糖濃度過(guò)高，黏度過(guò)大，大部分形成塊狀，不易成球。因此選擇殼聚糖的體積分?jǐn)?shù)為4%。

2.3 固定化條件的確定

2.3.1 戊二醛濃度的確定

考察不同的戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力和活力回收率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力及回收率的影響Fig.1 Effect of glutaraldehydeconcentration on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖1可知，隨著戊二醛濃度的提高，酶活力回收率和酶活力都隨之增加。但當(dāng)戊二醛濃度達(dá)到10 g/L后，再增加戊二醛濃度，酶活力回收率和酶活力開始下降。這是因?yàn)槲於┦且环N雙功能試劑，雙醛基可以與殼聚糖和酶分子上的氨基結(jié)合，將酶固定在殼聚糖微球上。但是當(dāng)戊二醛濃度過(guò)量，可能由于空間位阻和酶的多點(diǎn)連接，導(dǎo)致酶分子構(gòu)象改變而失活，從而降低酶的活力回收率和酶活力［10］。因此選擇戊二醛濃度為10 g/L。

2.3.2 戊二醛交聯(lián)時(shí)間的確定

分別取1.0 g殼聚糖微球5份，加入濃度為10 g/L的戊二醛5 mL，在30℃下120 r/min分別振蕩反應(yīng)0.5、1、2、4 和6 h。與酶固定化后，測(cè)定固定化酶的活力和計(jì)算活力回收率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力及回收率的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde timeon activity and recovery of immobilized enzyme

由圖2可知，在初始階段，戊二醛交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)，酶的活力回收率和酶活力也隨之提高。這說(shuō)明交聯(lián)劑戊二醛除了擴(kuò)散到殼聚糖微球內(nèi)部形成交聯(lián)反應(yīng)外，還有一部分戊二醛與殼聚糖的自由氨基反應(yīng)形成懸掛醛基［11］。當(dāng)跟游離酶固定化時(shí)，更多的酶分子跟懸掛醛基交聯(lián)，將酶固定在殼聚糖載體上。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)，酶活力和酶活力回收率兩個(gè)參數(shù)均達(dá)到最高值;但當(dāng)交聯(lián)時(shí)間繼續(xù)增加，兩個(gè)參數(shù)都有所下降，這是由于過(guò)多的醛基會(huì)導(dǎo)致酶變性失活。因此選擇最適的交聯(lián)時(shí)間是1 h。

2.3.3 酶濃度的選擇

在相同的固定化條件下，考察不同的酶濃度對(duì)酶活力和酶活力回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶濃度對(duì)固定化酶活力及回收率的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖3可知，隨著酶濃度的提高，酶活力回收率下降，而固定化酶活力卻持續(xù)上升。綜合考慮酶制劑的成本、酶活力和酶活力回收率，選擇酶濃度為1.0 mg/mL。

2.3.4 固定化時(shí)間的確定

在相同的條件下，考察酶固定化時(shí)間(2、4、6、8、10、12、14 h)對(duì)酶活力及活力回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力及回收率的影響Fig.4 Effect of immobilization time on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖4可知，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，活化的殼聚糖載體與酶的交聯(lián)吸附作用增加，固定化酶的活力和活力回收率不斷增加，當(dāng)固定化時(shí)間達(dá)到10 h后，載體與酶的作用達(dá)到飽和，反應(yīng)達(dá)到平衡，再繼續(xù)增加固定化時(shí)間，固定化酶活力和回收率都趨于穩(wěn)定，因此選擇的固定化時(shí)間是10 h。

2.3.5 酶固定化條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以酶活力回收率為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化酶固定化條件，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表3所示，正交結(jié)果分析見表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 3 Factors and levels in orthogonal experiment

由表4可以看出戊二醛濃度(A)、酶濃度(B)、交聯(lián)時(shí)間(C)和固定化時(shí)間(D)組合A2B3C2D3最好，即戊二醛濃度為10 g/L，酶濃度為1.5 mg/L，戊二醛交聯(lián)時(shí)間為1.0 h，固定化時(shí)間為12 h。

表4 正交結(jié)果分析Table 4 Orthogonal Results

采用以下條件制備固定化酶:殼聚糖的分子質(zhì)量為3×105，殼聚糖濃度(體積分?jǐn)?shù))為4%、二醛濃度為10 g/L，酶濃度為1.5 mg/L，戊二醛交聯(lián)時(shí)間為1.0 h，固定化時(shí)間為12 h，測(cè)定固定化酶的活力回收率達(dá)70.5%。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的采用殼聚糖固定化β-半乳糖苷酶的研究中，范家佑［6］采用殼聚糖固定半乳糖苷酶后，其酶活力回收率可以達(dá)到67%;而敖海英［5］以殼聚糖戊二醛交聯(lián)吸附法固定化半乳糖苷酶后，其酶活力回收率僅達(dá)到26.43%。因此綜合考慮固定化載體和固定化條件能夠?qū)崿F(xiàn)酶活力回收率的最優(yōu)化，使固定化酶更具有應(yīng)用價(jià)值。

2.4 固定化酶的應(yīng)用

2.4.1 固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

在無(wú)底物存在下，將固定化酶和游離酶在4℃下分別保存1、2、3、4和5周后，每周測(cè)定酶的活力，結(jié)果見圖5所示。

圖5 固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.5 Storage stability of immobilized enzyme

由圖5可知，游離酶在1周內(nèi)，酶活力下降了40%，而固定化酶的活力保持在96.2%。4周后，固定化酶的活力能夠保持原有活力的88.5%，而游離酶幾乎完全失活。這說(shuō)明β-半乳糖苷酶經(jīng)過(guò)固定化后，具有更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

2.4.2 固定化酶的操作穩(wěn)定性

將固定化酶在相同的條件下，使用5次，分別測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖6所示。

圖6 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.6 Operational stability of immobilized enzyme

由圖6可知，固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定，操作5次后，酶活力保持原有活力的67.3%，酶活力損失達(dá)到32.7%，具有較好的操作穩(wěn)定性。

Urrutia等［12］采用殼聚糖固定化 β-半乳糖苷酶后，重復(fù)使用10個(gè)周期，仍能保持超過(guò)70%的初始酶活性，當(dāng)在4℃和pH 7.0條件下保存93d后，β-半乳糖苷酶失去其初始酶活性的9.4%。Emese等［13］采用殼聚糖微球固定化β-半乳糖苷酶后，在4℃和pH 7.0下儲(chǔ)存3周，固定化酶的活力損失不超過(guò)5%。本實(shí)驗(yàn)固定化酶儲(chǔ)存4周后，仍能保持88.5%的活力，反復(fù)使用5次后，酶活力保持67.3%，其儲(chǔ)存和操作穩(wěn)定性都達(dá)到應(yīng)用的水平。

3 結(jié)論

采用殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化β-半乳糖苷酶。確定了固定化載體和固定化條件:殼聚糖的分子質(zhì)量為3×105，殼聚糖濃度(體積分?jǐn)?shù))為4%，交聯(lián)劑戊二醛濃度為10 g/L，交聯(lián)時(shí)間是1 h，酶濃度為1.5 mg/mL，固定化時(shí)間是12 h，最后測(cè)定固定化酶的活力回收率達(dá)70.5%。同時(shí)固定化酶具有良好的儲(chǔ)存和操作穩(wěn)定性:儲(chǔ)存時(shí)間4周后，保持88.5%的酶活力;重復(fù)操作5次后，保持67.3%的酶活力，具有良好的應(yīng)用前景。

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