宋彥麗，蔣細(xì)旺，王金新，張建

(江漢大學(xué) 生命科學(xué)院，湖北武漢，430056)

‘神農(nóng)香菊’(Dendranthema indicum(L.)Des Moul.var.aromaticum Q.H.Liu et S.F.Zhang)原產(chǎn)于湖北神農(nóng)架，為武漢植物研究所劉啟宏先生于1982年發(fā)現(xiàn)并命名的一種新資源植物，全株具有濃郁的香氣［1］。研究發(fā)現(xiàn)，‘神農(nóng)香菊’中含有豐富的揮發(fā)油［2］，揮發(fā)油存在于植物的油室、油管、分泌細(xì)胞或樹脂道中，由萜烯類化合物、醛酯類及醇類化合物等化學(xué)成分組成。國(guó)內(nèi)外研究表明揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理功能［3-6］，這引起了現(xiàn)代化食品、煙草、醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛關(guān)注［7～9］。

在植物性天然香料生產(chǎn)方法中，用于提取揮發(fā)油的方法主要有水蒸氣蒸餾法［10］、超臨界流體萃取法［11］、有機(jī)溶劑萃取法［12］等，從提取成本、產(chǎn)量、操作、環(huán)保、安全等多方面綜合考慮，選用成本低、操作簡(jiǎn)單、環(huán)保、產(chǎn)品安全系數(shù)高的水蒸氣蒸餾法來(lái)提取菊花揮發(fā)油在相關(guān)行業(yè)最具普遍性。

為了進(jìn)一步開發(fā)‘神農(nóng)香菊’，項(xiàng)目組在引種栽培、建立其體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的基礎(chǔ)上［13-15］，利用細(xì)胞工程技術(shù)以產(chǎn)于湖北省神農(nóng)架地區(qū)的‘神農(nóng)香菊’為材料獲得了相應(yīng)的耐熱體細(xì)胞無(wú)性系變異體［16-18］，經(jīng)過(guò)9 a的篩選、種植，獲得了性狀穩(wěn)定的茶用菊花新種質(zhì)(待發(fā)表)，暫命名為‘神農(nóng)菊’。迄今為止，對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取工藝與其在牛奶中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究以‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在蒸餾提取時(shí)間、提取料液比、提取氯化鈉濃度的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)［19-20］對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取條件進(jìn)行了分析和優(yōu)化，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了二次多項(xiàng)式回歸方程，得到了提取‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的最佳工藝條件，在其工業(yè)化生產(chǎn)中具有深遠(yuǎn)意義。同時(shí)，為了進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油，對(duì)最優(yōu)化條件下提取的揮發(fā)油進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料:‘神農(nóng)菊’，采自江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，處理后材料的含水率低于8%，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，保存于4℃冰箱備用。鮮牛乳，市售已經(jīng)過(guò)消毒滅菌的光明鮮牛乳(距生產(chǎn)日期2 d)。

NaCl、吐溫-80(乳化劑)等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取方法

取粉碎度為60目的‘神農(nóng)菊’試樣50 g，配制一定濃度的NaCl溶液，在燒杯中與‘神農(nóng)菊’充分混勻，置2 000 mL圓底燒瓶中，加數(shù)粒玻璃珠并振搖混合。參照中國(guó)藥典一部附錄XD并做一定的改動(dòng)，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加氯化鈉溶液使其充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，然后將燒瓶置電熱套中加熱至微沸，調(diào)壓并保持微沸狀態(tài)，自冷凝管滴下第1滴水開始計(jì)時(shí)，蒸餾一定時(shí)間，收集揮發(fā)油并精密稱重，計(jì)算提取率:

1.2.2 ‘神農(nóng)菊’提取物揮發(fā)油在牛奶中的抑菌效果

取750 mL的鮮牛乳均分為15份，分成3組，每組處理分別為空白對(duì)照、陰性對(duì)照、揮發(fā)油(最優(yōu)條件下提取)，10%吐溫-80溶液稀釋揮發(fā)油至適宜濃度(過(guò)濾除菌)，添加適量于鮮牛乳中使其濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%作為試驗(yàn)組，25℃水浴敞口放置。采用平板菌落計(jì)數(shù)法(參照GB4789.2-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》)，分別按照一定的稀釋梯度稀釋，并涂于固體培養(yǎng)基上于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。為減少偶然誤差，分別在試樣處理時(shí)與24 h水浴后在超凈工作臺(tái)上各測(cè)定一次，計(jì)算菌落總數(shù):

1.3 數(shù)據(jù)處理

相同提取條件與相同處理?xiàng)l件下，對(duì)樣品均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油的提取優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

分別就浸泡時(shí)間、蒸餾時(shí)間、料液比、NaCl濃度等實(shí)驗(yàn)因素對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油得率的影響進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響不顯著，而蒸餾時(shí)間、料液比、NaCl濃度對(duì)揮發(fā)油的得率影響較大。為進(jìn)一步了解蒸餾時(shí)間、料液比、NaCl濃度3種因素對(duì)揮發(fā)油提取率的影響特性，項(xiàng)目組通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)3種因素進(jìn)行了研究。

2.1.1.1 蒸餾時(shí)間對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的影響

按照1.2.1節(jié)的方法，設(shè)6組試驗(yàn)，溶劑為5%氯化鈉溶液，料液比為1∶10，而蒸餾時(shí)間分別設(shè)置為2、3、4、5、6、7 h，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，稱重并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，隨著蒸餾時(shí)間的增加，揮發(fā)油提取率不斷提高，蒸餾時(shí)間為5 h時(shí)得率最高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)，揮發(fā)油的得率反而有緩慢下降的趨勢(shì)。

圖1 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

根據(jù)鹽析法原理及傳熱傳質(zhì)原理［21-22］，隨著提取時(shí)間的增加，無(wú)機(jī)鹽離子在與揮發(fā)性成分爭(zhēng)奪水分子過(guò)程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，這使得從溶液中分離出來(lái)的揮發(fā)性物質(zhì)越來(lái)越多，并在提取時(shí)間5 h時(shí)提取率達(dá)到最大;但隨著時(shí)間的增加，無(wú)機(jī)鹽離子與水分子結(jié)合的過(guò)程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，且由于高溫環(huán)境破壞了部分沸點(diǎn)較高的揮發(fā)性成分，從而導(dǎo)致提取率下降。

綜合考慮提取效率和提取質(zhì)量，選擇提取時(shí)間為4～6 h作為進(jìn)一步研究的有效水平區(qū)間。

2.1.1.2 料液比對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的影響

按照1.2.1節(jié)的方法，設(shè)6組試驗(yàn)，溶劑為5%NaCl溶液，蒸餾時(shí)間3 h，料液比分別設(shè)置為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18(g∶mL)，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，稱重并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)揮發(fā)油的率的影響Fig.2 Effect of fliquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

由圖2可得隨著料液比的加大，揮發(fā)油得率不斷提高，當(dāng)料液比為1∶14時(shí)達(dá)到最高，隨著料液比的繼續(xù)加大，揮發(fā)油的得率緩慢減少。

由于無(wú)機(jī)鹽離子在提取體系中爭(zhēng)奪水分子能力有限，隨著料液比的增加，有效的揮發(fā)性分子量增加，在8～14倍溶劑倍量?jī)?nèi)，揮發(fā)油的提取率持續(xù)增加;但在14～18倍溶劑倍量范圍內(nèi)，由于其他成分的析出阻礙了揮發(fā)性成分的有效析出，故繼續(xù)增大溶劑倍量，反而降低了揮發(fā)油的提取率。

綜合考慮提取的效率及揮發(fā)油的純度，選擇料液比為1∶12～1∶16作為進(jìn)一步研究的有效水平區(qū)間。

2.1.1.3 NaCl濃度對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的影響

按照1.2.1節(jié)的方法，設(shè)6組試驗(yàn)，料液比為1∶10，蒸餾時(shí)間為3 h，NaCl濃度分別設(shè)置為0%、5%、10%、15%、20%、25%進(jìn)行水蒸氣蒸餾，稱重并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 NaCl濃度對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effect of concentration of sodium choride on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

由圖3可以看出隨著NaCl濃度的不斷加大，揮發(fā)油的得率不斷提高，當(dāng)NaCl濃度為15%是時(shí)，揮發(fā)油的得率達(dá)到了最高，隨著NaCl的濃度繼續(xù)加大，揮發(fā)油得率反而減少。

隨著NaCl濃度的增加，試驗(yàn)體系中無(wú)機(jī)鹽離子爭(zhēng)奪水分子的能力不斷增加，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)的溶解度不斷降低，故NaCl濃度在0% ～15%濃度內(nèi)，揮發(fā)油的得率不斷增加;但無(wú)機(jī)鹽濃度大于15%，隨著NaCl濃度的增加，由于樣品中其他難溶性成分析出阻礙了揮發(fā)性成分的分離，從而出現(xiàn)了持續(xù)增加無(wú)機(jī)鹽濃度，揮發(fā)油得率反而降低的現(xiàn)象。

綜合考慮提取的效率及揮發(fā)油的純度，選擇揮發(fā)油提取NaCl濃度為10% ～20%。

2.1.2 采用響應(yīng)面分析法對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

依據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合2.1.1節(jié)單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、溶劑倍量(即液料比)、NaCl濃度對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油得率影響顯著的3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法做了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Code values and actual values of the optimzation variables used in Box-Benhnken experimental design

2.1.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

以提取時(shí)間A、溶劑倍量B、氯化鈉濃度C為自變量，以變異菊花揮發(fā)油得率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 ‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油萃取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design and corresponding result of the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

2.1.2.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

用RAM軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:

式(3)中:Y為‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的預(yù)測(cè)值;A、B、C分別為蒸餾時(shí)間、溶劑倍量與NaCl濃度的編碼值。

各因素的方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 ANOVA of response surface parameters

從表3的方差分析可見，回歸方程各因子與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系具有顯著性。蒸餾時(shí)間A、NaCl濃度C、蒸餾時(shí)間與溶劑倍量的交互作用AB、溶劑倍量與NaCl濃度之間的交互作用BC均對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取率有顯著性影響，其 Prob值分別為0.037 5、0.015 2、0.041 7、0.043 7。

溶劑倍量B、蒸餾時(shí)間與NaCl濃度的交互作用AC對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取率無(wú)顯著性影響，Prob值分別為0.764 4、0.549 5。同時(shí)可以看出影響‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的各因素大小為C＞A＞B。由響應(yīng)面軟件SAS8.0.6得到的分析結(jié)果可知:模型的R=93.3%，證明這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，使用該方程模擬真實(shí)的3因子3水平的分析是可行的。

從表3可以看出，蒸餾時(shí)間與溶劑倍量的交互作用、溶劑倍量與NaCl濃度之間的交互作用顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4和圖6，蒸餾時(shí)間與NaCl濃度的交互作用見圖5。

2.1.2.4 模型的驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過(guò)解‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，得出最佳提取條件為:提取時(shí)間為5.18 h、溶劑倍量為14.15倍、NaCl濃度16.58%。在最佳化提取條件下，‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油提取率的預(yù)測(cè)值為0.566%。

為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，根據(jù)上述最優(yōu)提取條件，對(duì)‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油進(jìn)行了提取。同時(shí)為方便實(shí)際操作，節(jié)約生產(chǎn)成本，將‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的提取最佳條件修正為提取時(shí)間為5 h、溶劑倍量為15倍、氯化鈉濃度為16.5%，并在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的提取率均值為0.559%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明采用RSM法優(yōu)化得到揮發(fā)油的提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖4 蒸餾提取時(shí)間與溶劑倍量交互作用對(duì)變異菊花揮發(fā)油提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for the interactive effects of extraction time and fliquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

圖5 蒸餾提取時(shí)間與NaCl濃度交互作用對(duì)變異菊花揮發(fā)油提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of extraction time and concentration of sodium choride on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

圖6 NaCl濃度與溶劑倍量交互作用對(duì)變異菊花揮發(fā)油提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of concentration of sodium choride and liquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

2.2 ‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油對(duì)牛乳中微生物的抑制作用

通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)出每板菌落數(shù)，利用公式(2)計(jì)算出鮮牛乳在處理時(shí)與24 h敞口放置后總菌數(shù)。詳情見圖7和圖8。

圖7 處理時(shí)牛乳中微生物的總菌數(shù)Fig.7 The total count of microorganisms in milk processing

圖8 24 h后牛乳中微生物的總菌數(shù)Fig.8 The total count of microorganisms in milk after 24h

由圖7可以看出，處理時(shí)各個(gè)試樣的微生物數(shù)量相差不顯著;圖8試驗(yàn)結(jié)果顯示，25℃恒溫水浴24 h后微生物的數(shù)量達(dá)到107CFU/mL，空白對(duì)照與陰性對(duì)照牛乳中總菌數(shù)沒(méi)有明顯差異，加入‘神農(nóng)菊’提取物揮發(fā)油后較未加揮發(fā)油的牛乳中的總菌數(shù)明顯減少，且與揮發(fā)油濃度呈正相關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度高于25℃的夏天，鮮牛乳開蓋24 h后微生物數(shù)量已嚴(yán)重超標(biāo)，不再適宜飲用;‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油對(duì)微生物有明顯的抑制作用，但抑制作用有限。有相關(guān)研究報(bào)道植物揮發(fā)油具有一定的抗菌活性［23-24］，但對(duì)不同菌種的抑制程度差異較大，且抑菌成分及抑制機(jī)理等問(wèn)題尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

RSM法是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的方法，具有周期短、試驗(yàn)次數(shù)少、求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)RSM法得到提取‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油的最佳條件:提取時(shí)間5.18 h、溶劑倍量為14.15倍、NaCl濃度16.58%;兼顧操作性及生產(chǎn)成本，選取提取時(shí)間5 h、溶劑倍量為15倍、NaCl濃度16.5%的提取條件，得到實(shí)際提取率為0.559%，與理論預(yù)測(cè)值0.566%相差僅為0.11%;在試驗(yàn)過(guò)程中選擇NaCl溶液代替蒸餾水來(lái)提取揮發(fā)油明顯改善了揮發(fā)油貼壁與下沉的現(xiàn)象，這一結(jié)論對(duì)‘神農(nóng)菊’進(jìn)一步的開發(fā)、加工提供較好的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示‘神農(nóng)菊’揮發(fā)油具有一定的抑菌作用，并與揮發(fā)油的濃度成正相關(guān)。添加適量的揮發(fā)油除能延長(zhǎng)牛乳保質(zhì)期外又增添了揮發(fā)油的保健功能。這一研究結(jié)論為揮發(fā)油作為天然防腐劑來(lái)替代食品防腐劑提供了一定的理論參考，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 劉啟宏，張紅旗，賈衛(wèi)疆.湖北新資源植物——神農(nóng)香菊的地理分布、生態(tài)習(xí)性與蘊(yùn)藏量的調(diào)查研究［J］.武漢植物學(xué)研究，1983，1(2):239-246.

［2］ 姜從良，蘆金清，李竣，等.神農(nóng)香菊中揮發(fā)油、總黃酮與杭菊花、貢菊花的比較研究［J］.湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3(3):48-49.

［3］ Ukiya M，Akihisa T，Yasukawaet K，et al.Constituents of compositae plants.2.Triterpene diols，triols，and their 3-ofatty acid esters from edible chrysanthemum flower extract and their anti-inflammatory effects［J］.J Agric Food Chem，2001，49(7):3 187-3 197.

［4］ P.Alvarez Castellanos P，D Bishop C，Jpascual Villalobos M.Antifungal activity of the essential oil of flowerheads of garland chrysanthemum(Chrysanthemum coronarium)against agricultural pathogens［J］.Phytochem，2001，57(1):99-102.

［5］ Lee J S，Kim H J，Lee Y S.A new anti-HIV Flavonoid Glucuronide from Chrysanthemum morifolium［J］.Planta Med，2003，69(9):859-861.

［6］ SU J，TAN L，LAI P，et al.Experimental study on anti-inflammatory activity of a TCM recipe consisting of the supercritical fluid CO2extract of Chrysanthemum indicum，patchouli oil and zedoary turmeric oil in vivo［J］.J Ethnopharmacol，2012，141(2):608-614.

［7］ 房海靈，郭巧生，申海進(jìn).在5種食用油中野菊花揮發(fā)油的抗氧化能力研究［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19(2):54-59.

［8］ 謝超.神農(nóng)香菊抗氧化活性及其應(yīng)用研究［D］.武漢:湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012:57-74.

［9］ 田碩，苗明三.菊花的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)學(xué)，2014，29(190):378-380.

［10］ Mustafa Z.Ozel﹒ HilalKaymaz.Superheated water extraction，steam distillation and Soxhlet extraction of essential oils of Origanumonites［J］.Anal Bioanal Chem，2004，379(7/8):1 127-1 133.

［11］ JU Hen-yi，HUANG Kuo-chuan，Chen Jiann-Hwa，et al.Optimization of the extraction of Alpiniaoxyphylla essence oil in supercritical carbon dioxide［J］.J Am Oil ChemSoc，2010，87:1 063-1 070.

［12］ 蔣紅梅，盧向陽(yáng)，方俊，等.石香薷揮發(fā)油提取工藝研究［J］.中藥材，2007，9(30):1 135-1 139.

［13］ 蔣細(xì)旺，張啟翔.地被菊間接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的轉(zhuǎn)基因受體體系的研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2007，20(3):328-333.

［14］ 蔣細(xì)旺，陳發(fā)菊，陸苗，等.地被菊直接體細(xì)胞胚發(fā)生研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(2):65-70.

［15］ JIANG X W，ZHANG Q X，ZHANG P，et al.Heat tolerance of ground-cover Chrysanthemum［J］.Acta Horticulturae，2008，766:89-96.

［16］ JIANG X W，YANG X.High semi-lethal temperature and heat tolerance of tea Chrysanthemum［J］.Acta Horticulturae，2013，977:369-376.

［17］ 楊小秋，韓磊，傅厚暾，蔣細(xì)旺.高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定茶(藥)用菊花的綠原酸含量［J］.分析儀器，2013(1):12-15.

［18］ 蔣細(xì)旺.花草茶的種類、保健功能及使用［J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，10(17):62-66.

［19］ Macros A B，Ricardo E.S，Eliane P O，et al.Response surface methodology(RSM)as a tool for optimization in analytical chemistry［J］.Talanta，2008，76(5):965-977.

［20］ LI Quan-hong，F(xiàn)U Cai-li.Application of response surface methodology forextraction optimization ofgerminant pumpkin seeds protein［J］.Food Chem，2005，92(4):701-706.

［21］ 楊義芳.中藥與天然活性產(chǎn)物分離純化和制備［M］.北京:科學(xué)出版社，2011.

［22］ Frank P Incropera.Fundamentals of heat and mass Transfer［M］.The United States of America:John Wiley ＆Sons Inc，2006.

［23］ Ahlem Ben Sassi，F(xiàn)ethia Harzallah-Skhiri，Imed Chraief，et al.Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oil of(Tunisian)Chrysanthemum trifurcatum(Desf.)Batt.and Trab.flowerheads［J］.Science-Direct，2008，11:324-330.

［24］ Bajpai Vivek K，Sharma Ajay，Baek Kwang-Hyun.Antibacterial mode of action of Cudrania tricuspidata fruit essential oil，affecting membrane permeability and surface characteristics of food-borne pathogens［J］.Food Control，2013，32(2):582-590.