孫灑灑，沈照鵬，孟蕾，江曉路，3

1(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)2(中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島，266003)3(青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島，266071)

蟲花Isaria farinosa 04-1是蟲草的一種，其無性型為粉質(zhì)擬青霉 Paecilomyces farinosus，所含營養(yǎng)與藥用成分與野生蟲草的種類相同，含量相當(dāng)甚至更高［1］，是冬蟲夏草的潛在替代品。

蟲草液態(tài)培養(yǎng)能產(chǎn)生蟲草素、蟲草酸、腺苷和蟲草多糖等物質(zhì)，其中蟲草多糖是最重要、最豐富的藥理活性成分，有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效［2］，它在抗氧化方面的作用越來越受到關(guān)注［3］。生物活性多糖具有營養(yǎng)和保濕雙重功能，作為功效性添加劑應(yīng)用于化妝品中，符合保濕劑的發(fā)展方向和市場需要，有較高的研究價值［4］，但蟲草多糖在此方面的應(yīng)用研究較少。已有報道表明蟲花菌絲體和發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)對細菌有廣譜抗性，胞外糖蛋白有一定的抑瘤作用［5］，但國內(nèi)外對蟲花液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖及胞外多糖(EPS)活性的研究較少。本文探討了蟲花培養(yǎng)過程中菌體生物量、發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖能力。此外，還考察了EPS的吸濕保濕性、清除羥自由基及螯合鐵離子的能力，旨在確定蟲花液體培養(yǎng)的最佳條件及EPS的生物活性，探討其在化妝品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用價值，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江曉路教授提供，經(jīng)形態(tài)學(xué)與ITS序列分析鑒定命名為Isaria farinosa 04-1［6］。

1.1.2 試劑

苯酚、濃 H2SO4、FeSO4、水楊酸、H2O2、VC、EDTA、菲洛嗪等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)化試驗

1.2.1.1 碳源的確定

選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源。

1.2.1.2 氮源的篩選

以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3為不同氮源進行篩選。

1.2.1.3 最佳初始pH的確定

按基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，以確定的適宜碳、氮源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的初始 pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0來確定最佳條件。

1.2.1.4 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

用選出的適宜碳、氮源及 pH，設(shè)置 23、25、28、30、32℃探討溫度的影響。

1.2.1.5 正交試驗

以菌絲體干重及EPS含量為指標(biāo)，利用L9(34)正交表確定單因素篩選出的4個因素的水平范圍(見表1)，根據(jù)因素水平表進行試驗操作。

表1 正交試驗的因素與水平表Table 1 Experimental factors and their levels for orthogonal design

以上試驗均采用5% 的接種量，轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時間為48 h。

1.2.2 蟲花生物量及EPS含量測定

蟲花生物量:以菌絲體干重來衡量，取發(fā)酵液離心(4 800 r/min，10 min)，菌絲體沉淀放在干燥潔凈的平板中烘干(50℃)至恒重后稱重。

EPS含量測定:取發(fā)酵液離心(4 800 r/min，10 min)后的上清液，添加5倍乙醇，振蕩混勻后，離心(4 800 r/min，10 min)取沉淀，加水復(fù)溶后得糖溶液，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過苯酚-硫酸法［7］進行測定。

1.2.3 多糖活性探索

1.2.3.1 多糖的吸濕保濕能力

參照 ZHAO［8］的方法以甘油(Glycerol)和透明質(zhì)酸(HA)為對照。

1.2.3.2 多糖清除羥自由基的能力

Fenton法［9-10］:VC和蒸餾水分別為陽性和空白對照。EC50是清除率為50% 時的樣品濃度，值越大，表明清除活性越弱;反之，越強［11］。

1.2.3.3 多糖螯合鐵離子的能力

菲洛嗪法:EDTA和蒸餾水分別為陽性和空白對照［12］。螯合能力以螯合率達50% 時的樣品濃度即EC50來衡量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 19進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 不同碳源對菌絲體干重和糖含量的影響

如圖1a所示，相對葡萄糖和麥芽糖，蔗糖的作用效果較顯著，轉(zhuǎn)化合成的多糖較多，達1.368 g/L，菌體生長較好，菌絲體干重達10.790 g/L;而且蔗糖比葡萄糖和麥芽糖穩(wěn)定，不易被氧化，能提高發(fā)酵培養(yǎng)基的穩(wěn)定性［13］，因此選用蔗糖為最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對菌絲體干重和糖含量的影響

從圖1b可看出，有機氮源比無機氮源作用效果好，菌體生長較好且轉(zhuǎn)化成的EPS較多。因此，蟲花液體培養(yǎng)的適宜氮源為牛肉膏、蛋白胨和酵母膏。當(dāng)使用蛋白胨做氮源時，菌絲體干重比牛肉膏做氮源時略高，但糖含量(2.065 g/L)相對牛肉膏(2.283 g/L)較低，因此，當(dāng)以獲得EPS為目的時，選用牛肉膏為最佳氮源。

圖1 不同條件對菌絲體干重和糖含量的影響Fig.1 The effect of different conditions on dry weight of mycelium and polysaccharide content

2.1.3 不同初始pH對菌絲體干重和糖含量的影響

由圖1c可知，不同初始pH對菌絲體干重的影響較小，中性偏酸的環(huán)境有利于產(chǎn)糖，隨pH值的增加，糖含量呈下降趨勢。以糖含量為指標(biāo)，參考菌絲體量，以pH值為6.0較適宜。

2.1.4 不同培養(yǎng)溫度對菌絲體干重和糖含量的影響

培養(yǎng)溫度對菌絲體干重和糖含量的影響較明顯(如圖1d所示)。25℃時的菌絲體干重和糖含量都比其他溫度高，可見，25℃比較有利于菌株生長及產(chǎn)糖。此外，當(dāng)溫度超過30℃時，菌株生長迅速變慢，可見，高溫對菌絲體生長及代謝產(chǎn)物的積累均有一定的抑制作用，適當(dāng)控制培養(yǎng)溫度可以提高產(chǎn)量并降低能耗［14］。

2.1.5 正交試驗分析

2.1.5.1 直觀分析

以菌絲體干重(g/L)和 EPS含量(g/L)為指標(biāo)的均值及極差分析如表2所示。由極差大小可知決定菌絲體干重和 EPS含量的因子主次順序為:蔗糖＞牛肉膏 ＞初始 pH值 ＞溫度，最佳組合均為A3B3C3D1，即100 mL培養(yǎng)基中含蔗糖2.5 g，牛肉膏0.8 g，初始pH值為4.0，培養(yǎng)溫度為28℃。因素間的交互作用使得最佳組合與單因素確定的最優(yōu)條件略有差異。

表2 菌絲體干重和EPS含量的正交試驗分析Table 2 Application of L9(34)orthogonal design to dry weight of mycelium and EPS production

2.1.5.2 正交試驗驗證

按正交試驗選出的最佳組合配制培養(yǎng)基并在相應(yīng)條件下培養(yǎng)蟲花，優(yōu)化前后的結(jié)果如表 3所示。由表3可知，菌絲體干重和EPS含量分別比優(yōu)化前提高了13.05%和37.66%。

表3 優(yōu)化前后菌絲體干重及EPS含量比較Table 3 Dry weight of mycelium and EPS production comparison of optimization

2.2 多糖的吸濕保濕能力

2.2.1 多糖的吸濕能力

在飽和硫酸銨溶液(相對濕度RH=81%)環(huán)境下，由圖2a所示，前12 h內(nèi)，EPS比HA的吸濕率高，經(jīng)緩慢增加后逐漸平衡。120 h后，最大吸濕率分別為:甘油(71.39%)＞透明質(zhì)酸(16.81%)＞EPS(10.94%)。由圖2b可知，在飽和碳酸鈉溶液(RH=43%)環(huán)境下的吸濕率與在RH為81% 的環(huán)境中有相同的趨勢。120 h后，最大吸濕率分別為:甘油(98.11%)＞透明質(zhì)酸(26.13%)＞EPS(18.54%)。兩種濕度下多糖的吸濕率持久穩(wěn)定且無明顯下降，在同一時段，RH大的環(huán)境下多糖吸濕率反而小，說明吸濕率與濕度沒有必然關(guān)系，這與陳剛等［15］的研究結(jié)果一致。

2.2.2 多糖的保濕能力

在干硅膠(RH=0)環(huán)境下，由圖2c可知，0～24 h內(nèi)，EPS與甘油的水分殘存率相當(dāng)。120 h后，各樣品的最大水分殘存率分別為:HA(24.31%)＞甘油(12.33%)＞EPS(2.02%)。如圖2d所示，RH=43%時，0～72 h內(nèi)，EPS與HA的水分殘存率相當(dāng)。120 h后，各樣品的最大水分殘存率分別為:甘油(85.70%)＞EPS(81.16%)＞HA(78.87%)。由此可知，該糖具備較好的吸濕保濕能力，有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

圖2 不同RH下樣品的吸濕和保濕能力Fig.2 Moisture absorption and retention abilities of samples at different RH

2.3 多糖對羥自由基的清除作用

蟲花EPS對羥自由基的清除作用較明顯，如圖3所示，隨糖濃度的增加而增加并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其EC50為1.285 mg/mL，羥基清除率大于同等濃度下張小強等［16］的研究結(jié)果。

圖3 EPS對羥自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of EPS on hydroxyl radicals

2.4 多糖的螯合作用

在過渡金屬中，鐵因其高活性而被稱為最重要的脂質(zhì)過氧化促氧化劑，有效的亞鐵離子絡(luò)合劑可以避免脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的損傷［17］。蟲花 EPS因螯合Fe2+干擾了Fe2+-菲洛嗪復(fù)合物的形成，螯合能力跟糖濃度呈正相關(guān)，EC50值為2.606 mg/mL(見圖4)。

圖4 EPS對Fe2+的螯合作用Fig.4 Chelating ability of EPS on Fe2+

3 討論

本文對1株蟲花(Isaria farinosa 04-1)的產(chǎn)糖條件進行了優(yōu)化，在實驗中發(fā)現(xiàn)，菌絲體量跟EPS含量并不呈現(xiàn)嚴格正相關(guān)，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)具體所需有側(cè)重地調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，以更大限度地得到目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)正交優(yōu)化后，蟲花菌絲體量比優(yōu)化前提高了13.05%，高于已有報道［18］的冬蟲夏草菌絲體量(10.200 g/L);EPS產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了37.66%，比趙明文等［19］研究的蛹蟲草EPS產(chǎn)量(1.830 g/L)高38.13%。這些研究為今后蟲花多糖的生產(chǎn)應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

從天然物質(zhì)中提取的具有營養(yǎng)和保濕雙重功能的天然保濕劑符合保濕劑的發(fā)展趨勢，天然多糖正是一類不可多得的天然保濕材料［20］。對蟲花多糖的研究表明，其吸濕性優(yōu)于透明質(zhì)酸;在飽和碳酸鈉環(huán)境中，具有與透明質(zhì)酸相當(dāng)?shù)谋衲芰?，可作為透明質(zhì)酸代用品，用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。此外，天然多糖是一類非常有前途的食藥用抗氧化劑［21］。該蟲花胞外多糖具有優(yōu)異的羥自由基清除能力及良好的螯合鐵離子能力，能減少脂質(zhì)過氧化帶來的損傷，為其成為新型抗氧化劑并以高檔保健品形式滿足市場需求提供了可能。

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