閻賀靜，劉暢，時(shí)月，李潤豐

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北昌黎，066600)

殼聚糖降解后理化性質(zhì)和生理活性都發(fā)生了變化，所得殼寡糖不僅易于被人體吸收利用，還具有許多獨(dú)特的生理活性和功能，例如:能提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、活化增殖人體腸道內(nèi)雙歧桿菌等［1-2］。同時(shí)還具有抗菌防腐、保水保濕等功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品、保健品等方面的應(yīng)用前景令人矚目［3-4］。由殼聚糖制備殼寡糖可通過化學(xué)降解、物理降解和酶降解進(jìn)行［5-6］。與目前常用的化學(xué)降解法相比，酶法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和易控，寡糖得率高、功能性更強(qiáng)，不易造成環(huán)境污染，是殼寡糖最理想的制備方法。

殼聚糖酶(chitosanase)又稱殼聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，對殼聚糖降解具有專一性是殼聚糖制備殼寡糖最理想的酶制劑［7-8］，在工業(yè)上已有用于制備殼寡聚糖(Chitooligosaccharides，簡稱 COSs)的實(shí)例。雖然目前殼聚糖酶已經(jīng)商品化，但由于原始菌株產(chǎn)殼聚糖酶能力仍然普遍偏低，使得殼聚糖酶的來源有限，生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致商品殼聚糖酶價(jià)格居高不下［9-10］。同時(shí)目前的商品殼聚糖酶在熱穩(wěn)定性等方面還不足以適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化降解殼聚糖的生產(chǎn)。目前的研究重點(diǎn)是采用不同的生物技術(shù)來提高殼聚糖酶生產(chǎn)菌的產(chǎn)酶能力。

本實(shí)驗(yàn)首先確定了煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶受碳源的誘導(dǎo)，通過不同碳源對煙曲霉WHSW-01細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的影響，確定對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶起最佳誘導(dǎo)作用的碳源，并進(jìn)一步確定該最佳誘導(dǎo)碳源的添加量和添加時(shí)間來提高煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的能量，在節(jié)約成本的前提下提高殼聚糖酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

菌種:煙曲霉WHSW-01(由武漢生物工程學(xué)院酶工程教研室提供)［11］;

試劑:瓊脂粉，NaCl、MgSO4·7H2O 等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面(平板)培養(yǎng)基:膠體殼聚糖 1%，(NH4)2SO40.5%，K2HPO40.2%，NaCl 0.5%，Mg-SO4·7H2O 0.1%，瓊脂2.0%，pH6.5。1%膠體殼聚糖的配制:每100 mL pH5.0的醋酸緩沖液中溶解1 g粉末殼聚糖。

搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基:NH4NO31.0%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.5%，酵母提取物0.5%，碳源(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而變)。

1.3 研究方法

1.3.1 殼聚糖酶的搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)基為自然pH，搖瓶裝液量70 mL/250 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 還原糖的測定

采用 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［12］。

1.3.3 DNS法測殼聚糖酶活力

先將加有1 mL的pH 5.6醋酸緩沖液和0.9 mL的1%標(biāo)準(zhǔn)膠體殼聚糖溶液的試管在50℃保溫5 min，再加入0.1 mL的4 000 r/min離心15 min后的初酶液，于50℃下水浴保溫15 min，加入1.5 mL的DNS終止酶促反應(yīng)，顯色沸水浴5 min，自然冷卻，然后加入21.5 mL的蒸餾水，平衡后于4 000 r/min離心15 min，取上清液在可見光520 nm處測吸光度，根據(jù)氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線求出反應(yīng)液中的還原糖含量。酶活定義:1 mL酶液1 min催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)單位(U/mL)。

1.3.4 殼聚糖水解液的制備

用1%膠體殼聚糖作搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基的碳源，取發(fā)酵到第3天的粗酶液10 mL，于50℃下水解450 mL的1%標(biāo)準(zhǔn)殼聚糖溶液50 min。

1.3.5 殼聚糖酶生物合成調(diào)節(jié)模式的考察

分別以1%殼聚糖膠體、0.5%膠體殼聚糖和0.5%葡萄糖、1%葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的基本碳源進(jìn)行殼聚糖酶的搖瓶發(fā)酵，每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活。

1.3.6 不同碳源對WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以1%葡萄糖和1%氨基葡萄糖鹽酸鹽、2%氨基葡萄糖鹽酸鹽、1%葡萄糖和1%殼聚糖膠體、1%葡萄糖和1%粉末殼聚糖、2%葡萄糖、1%葡萄糖和1%殼聚糖水解液為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶酶活，考察不同碳源對WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.7 最佳誘導(dǎo)劑添加量對WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

將最佳誘導(dǎo)劑按照發(fā)酵液總體積的10%、20%、40%、60%的量在發(fā)酵初始添加，每隔24 h測殼聚糖酶的酶活和細(xì)胞生物量，考察最佳誘導(dǎo)劑的不同添加量對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.8 最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

將最佳劑量的誘導(dǎo)劑分別在發(fā)酵進(jìn)行的0、12、24、48、72、96 h 添加到發(fā)酵液中，每隔 24 h 測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活和細(xì)胞的生物量，考察最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.9 生物量的測定方法

采用細(xì)胞干重測量法［13］。

2 結(jié)果和分析

2.1 煙曲霉WHSW-01中殼聚糖酶生物合成的調(diào)節(jié)模式

酶生物合成的調(diào)節(jié)模式主要有分解代謝物阻遏作用、誘導(dǎo)作用、反饋?zhàn)瓒糇饔茫?4］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)真菌中殼聚糖酶的合成模式以誘導(dǎo)型為主［15］。按照1.3.5方法確定煙曲霉WHSW-01合成殼聚糖酶是否受殼聚糖誘導(dǎo)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源對殼聚糖酶生物合成的影響Fig.1 Effects of different carbon on chitosanase biosynthesis

由圖1可見，不同碳源對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響不同。當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，殼聚糖酶的合成量較低，最高酶活為0.89 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中存在膠體殼聚糖時(shí)，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的量較高。例如，以膠體殼聚糖為唯一碳源以及以葡萄糖和殼聚糖為碳源時(shí)，殼聚糖酶酶活最高分別為2.3 U/mL和2.89 U/mL。由此可見，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶是受殼聚糖的誘導(dǎo)的。僅以葡萄糖作為碳源，不利于殼聚糖酶的合成，以葡萄糖為基礎(chǔ)碳源，添加殼聚糖有利于該煙曲霉的產(chǎn)生。

2.2 不同誘導(dǎo)劑對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

以不同物質(zhì)及不同形式的殼聚糖作為碳源，對微生物的生長和產(chǎn)酶有不同的影響。按1.3.6所示的方法分別添加不同碳源進(jìn)行發(fā)酵。每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活，考察不同碳源對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，不同碳源對殼聚糖酶的合成有不同的影響。分別以葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽以及葡萄糖和氨基葡萄糖鹽酸鹽為碳源時(shí)，最高酶活分別為0.95、3.4和1.6 U/mL;分別以葡萄糖和殼聚糖水解液、葡萄糖和殼聚糖粉末以及葡萄糖和膠體殼聚糖為碳源時(shí)，最高酶活分別為4.75、1.59和2.81 U/mL。并且碳源不同，該曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶周期不同，以氨基葡萄糖鹽酸鹽及葡萄糖和殼聚糖粉末為碳源時(shí)，產(chǎn)酶高峰期出現(xiàn)在發(fā)酵的96 h，其他碳源發(fā)酵至120 h達(dá)產(chǎn)酶高峰期。由此可見，碳源不僅影響產(chǎn)酶酶量的高低，同時(shí)影響產(chǎn)酶周期，其中以殼聚糖水解液為碳源時(shí)殼聚糖酶產(chǎn)量最高。推測可能是由于殼聚糖水解液中含有某低聚殼寡糖對該曲霉的生長和產(chǎn)酶都有促進(jìn)作用。但由于殼聚糖水解液由殼聚糖水解獲得，水解液組成成份十分復(fù)雜，對殼聚糖酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的具體原因需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖2 不同碳源對殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction of different carbon resources on chitosnase production

圖3 殼聚糖水解液添加量對煙曲霉生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different chitosan hydrozate amount on A.fumigates WHSW-01growth and chitosanase production

2.3 殼聚糖水解液對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

為進(jìn)一步提高該煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的量，需要進(jìn)一步確定殼聚糖水解液添加量，按照1.3.7的方法進(jìn)行發(fā)酵，每隔24 h測發(fā)酵液中細(xì)胞干重和殼聚糖的酶活力，結(jié)果如圖3a和圖3b所示。

由圖3b可知，殼聚糖水解液添加量不同，對殼聚糖酶的合成影響也不同。其中添加占發(fā)酵液總體積40%的殼聚糖水解液進(jìn)行發(fā)酵，其殼聚糖酶酶活產(chǎn)量最高，發(fā)酵至120 h達(dá)最高酶活4.88 U/mL。當(dāng)繼續(xù)增加殼聚糖水解液添加量至60%殼聚糖酶產(chǎn)量降低(圖3b所示)。分析原因可能是由于殼聚糖水解液添加量較高時(shí)，某種殼聚糖水解產(chǎn)物含量較高，對殼聚糖酶的合成產(chǎn)生了抑制作用。此外，根據(jù)圖3a和3b所示，發(fā)現(xiàn)煙曲霉WHSW-01發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的開始時(shí)間與細(xì)胞的生長同步，但當(dāng)發(fā)酵至72 h后細(xì)胞生物量開始減少，而殼聚糖的酶活卻繼續(xù)增加，直至發(fā)酵至120 h酶活達(dá)到最大值。由此可以說明，以殼聚糖水解液為誘導(dǎo)碳源時(shí)，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型。此類型的合成模式特點(diǎn)是細(xì)胞停止生長而酶仍在繼續(xù)合成，因此會(huì)積累大量的目的酶，這是酶生物合成的最佳合成模式［14］。

2.4 殼聚糖水解液添加時(shí)間對煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

為進(jìn)一步提高殼聚糖酶的產(chǎn)量，按照1.3.8所示的方法考察了殼聚糖水解液的添加時(shí)間，每隔24 h測殼聚糖酶的活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 殼聚糖水解液加時(shí)間對煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.4 Effects of chitosan hydrozate addition time on chitosanase production

由圖4可見，在不同時(shí)間添加殼聚糖水解液，對WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響不同。其中發(fā)酵0 h和12 h時(shí)添加殼聚糖水解液產(chǎn)酶效果最佳。兩者在發(fā)酵至120 h均達(dá)到產(chǎn)酶高峰，最高酶活分別為5.25 U/mL和6.78 U/mL。隨著殼聚糖水解液添加時(shí)間的滯后，該菌株的產(chǎn)酶量逐漸降低，由此可見殼聚糖水解液的添加最好在發(fā)酵初期進(jìn)行。

圖5為發(fā)酵12 h時(shí)添加殼聚糖水解液時(shí)細(xì)胞生長和產(chǎn)酶情況。在發(fā)酵至48 h時(shí)細(xì)胞生物量達(dá)到最大，即細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵至72 h以后細(xì)胞生長進(jìn)入了衰亡期。然而發(fā)酵產(chǎn)酶高峰期卻出現(xiàn)在發(fā)酵進(jìn)行至120 h時(shí)，最高酶活達(dá)到6.78 U/mL。分析酶產(chǎn)量增加的原因可能如下，(1)發(fā)酵進(jìn)行至12 h添加殼聚糖水解液，有利于發(fā)酵初期煙曲霉利用速效碳源迅速繁殖，使細(xì)胞大量積累，而后誘導(dǎo)劑的添加使細(xì)胞大量產(chǎn)酶;(2)由圖5可以判斷，此條件下煙曲霉WHSW-01殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型，即細(xì)胞停止生長后酶繼續(xù)合成，酶的合成時(shí)間較其他類型的合成模式長，因此殼聚糖酶的產(chǎn)量增加;(3)由于煙曲霉為絲狀真菌，搖瓶振蕩發(fā)酵時(shí)，菌絲相互纏繞而形成菌絲球，發(fā)酵期間菌絲球內(nèi)會(huì)包裹大量的酶液，當(dāng)發(fā)酵后期菌絲球出現(xiàn)自溶，包裹在菌絲球中的殼聚糖酶被釋放到發(fā)酵也中，這在表觀上體現(xiàn)在發(fā)酵液酶活的提高［15］。綜上所述，煙曲霉 WHSW-01在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(基礎(chǔ)碳源為1%的葡萄糖)發(fā)酵至12 h時(shí)間添加殼聚糖水解液最佳，有利于微生物細(xì)胞的繁殖和積累，殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型，合成時(shí)間比較長，產(chǎn)酶量較高。

圖5 發(fā)酵12 h添加殼聚糖水解液條件下細(xì)胞生長及產(chǎn)酶Fig.5 Curves of A.fumigates WHSW-01growth and chitosanase production in condition of chitosan hydrozate additon after fermentation continued 12 h

3 討論與結(jié)論

殼聚糖酶是高效、特異降解殼聚糖的酶。關(guān)于殼聚糖酶的研究，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的工作。一方面利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)挖掘新型殼聚糖酶基因并進(jìn)行高效表達(dá)［16-19］;另一方面通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化［20-25］，在一定程度上提高了殼聚糖酶的產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉WHSW-01在只含有葡萄糖的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較好，但產(chǎn)酶量極低;而在含有葡萄糖和殼聚糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶量大大增加，說明該菌種產(chǎn)殼聚糖酶受殼聚糖的誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖水解液對殼聚糖酶的產(chǎn)生具有更大的誘導(dǎo)作用，比使用膠體殼聚糖做誘導(dǎo)劑時(shí)最高酶活提高1.35倍。本文研究確定，WHSW-01在基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵至12 h時(shí)添加占發(fā)酵液總體積40%的殼聚糖水解液產(chǎn)酶量最高為6.78 U/mL，與前期煙曲霉WHSW-01基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下最高酶活3.7 U/mL相比提高了83.24%［26］。其實(shí)，對于酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在確定基本培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，還可通過多種手段提高細(xì)胞產(chǎn)酶能力。曾有學(xué)者在培養(yǎng)過程中采用熱激作用提高了殼聚糖酶的產(chǎn)量［27-28］。Sinha等利用蝦蟹殼來源的幾丁質(zhì)水解物作培養(yǎng)基進(jìn)行殼聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)，也達(dá)到了提高殼聚糖酶產(chǎn)量的目的［29］。也有人在發(fā)酵過程中通過分階段控制營養(yǎng)物質(zhì)、pH等策略提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，確實(shí)得到了不錯(cuò)的效果［30-31］。有研究表明，微生物產(chǎn)殼聚糖酶受不同碳源的誘導(dǎo)作用［15，32］。對于既定的殼聚糖酶生產(chǎn)菌，考察誘導(dǎo)物及其誘導(dǎo)條件，在一定程度上可以提高酶的產(chǎn)量。本文的研究正是基于此目的進(jìn)行的，結(jié)果表明使用殼聚糖水解液可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量。雖然本研究并未使酶產(chǎn)量提高很大，與基因工程菌殼聚糖酶的產(chǎn)量無法相比［18］，但與菌種誘變及發(fā)酵基本條件優(yōu)化等對殼聚糖酶產(chǎn)量的提高相比［21-24］，本研究中殼聚糖酶產(chǎn)量的提高還是比較明顯的;此外，碳源的誘導(dǎo)策略應(yīng)用于基因工程菌，也很有可能使產(chǎn)酶有較大的提高;同時(shí)本研究也為下一步的研究提供了方向，例如:可以進(jìn)一步考察殼聚糖水解成分如低聚合度殼聚糖對殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用，由此進(jìn)一步提高產(chǎn)酶;此外還可以展開低聚殼聚糖對煙曲霉誘導(dǎo)作用機(jī)理的研究，為煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵過程的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

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