張露，陳建國，李雪，李金霞，譚望橋，程池

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

2(海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南?？?，570125)

諾尼(noni)是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木，又名海巴戟，海巴戟天，蘿荔。學(xué)名Morinda citrifolia Linn.，為茜草科巴戟天屬植物，原產(chǎn)于一些太平洋島嶼、東南亞和澳大利亞等地，現(xiàn)引種于我國海南省。諾尼果有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，被人們稱為“神奇果”［1-4］。酚酸是植物多酚類物質(zhì)的一類，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、保護心血管等作用，與人體健康密切相關(guān)，逐漸成為研究熱點［5-10］。國內(nèi)外對酚酸類化合物的高效液相色譜分析方法已有報道，李永庫等利用固相萃取檢測葡萄酒中的8種酚酸類化合物，姜莉等利用HPLC測定黑米酒中11種酚酸類物質(zhì)［11-15］。諾尼果汁含有豐富的多酚類活性物質(zhì)，其中酚酸種類較多，因此建立諾尼果汁中酚酸類物質(zhì)的測定方法，分析各酚酸含量具有重要意義。目前，尚未有對諾尼果汁酚酸含量的測定研究。本文建立了一種新型、簡單、同時測定諾尼果汁中6種酚酸的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DAD-3000二極管陣列檢測器，Chromeleon 7色譜工作站，Thermo Fisher公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA-RV10(德國艾卡公司)。

標準品沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸，購自北京百靈威科技有限公司(純度≥98%);甲醇、冰醋酸為色譜純，乙酸乙酯為分析純;實驗所用水均為超純水。

西沙諾尼果汁，由海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為 20121228、20130105、20130603、20140313、20140325 和20140326。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準品溶液制備

分別稱取標準品沒食子酸50 mg、龍膽酸100 mg、P-羥基苯甲酸500 mg、綠原酸 200 mg、咖啡酸 50 mg、阿魏酸30 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合標準品儲備液，于冰箱4℃避光保存。分別取混合標準品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 定容至10 mL，配制成系列混和標準品溶液。測定前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣量為1μL。

1.2.2 樣品的制備［15-17］

取15 mL諾尼果汁，每次用45 mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(真空，40℃)濃縮后，殘渣溶于1 mL體積分數(shù)50%甲醇中，置于冰箱4℃避光保存，待液相分析用。測定前樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣量為10μL。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:Thermo Accucore XL C18(250 mm×4.6 mm，4 μm);柱溫:30℃;流動相:A液0.95%冰醋酸溶液;B液 甲醇;梯度洗脫條件見表1;流速:0.8 min/mL;檢測器:Thermo DAD-3000檢測波長:280nm和330nm(龍膽酸、咖啡酸和阿魏酸變波長為330nm處檢測，其他3種酚酸在280nm處檢測)。在上述色譜條件下，取標準品溶液和樣品溶液分別進樣，記錄色譜圖。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件的選擇

2.1.1 檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器對6種酚酸進行波長掃描，其中沒食子酸、P-羥基苯甲酸在280 nm處有較強吸收;龍膽酸在330 nm處有較強吸收;綠原酸、咖啡酸、阿魏酸在280、330 nm處均有較強吸收，且樣品分析中咖啡酸和阿魏酸在330 nm處，雜質(zhì)干擾較小。綜合考慮，選擇龍膽酸、咖啡酸和阿魏酸變波長在330 nm處檢測，其他組分在280 nm處檢測。

2.1.2 流動相的選擇

由于酚羥基、羧基在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰拖尾嚴重。加入少量酸性調(diào)節(jié)劑，可使多酚的電離受到抑制，極性減弱，增強其在固定相上的保留，使分離效果和峰形得到改善。本實驗采用冰醋酸作為流動相酸性調(diào)節(jié)劑，冰醋酸的濃度對酚酸的出峰時間和峰型有著一定的影響。考察了0.5%～9%不同濃度冰醋酸溶液對6種酚酸的分離效果，最終選擇了含0.95%冰醋酸溶液，6種酚酸組分能較好分離，且各組分之間分離度均大于2.4，因此本試驗流動相采用A液(0.95%冰醋酸水溶液)和B液(甲醇)。

2.1.3 梯度洗脫條件優(yōu)化

本實驗進行了多種梯度洗脫條件研究，最終確定以下洗脫程序:0～11 min，B液為5%;11～17 min，B液為20%;17～22 min，B液為 30%;22～50 min，B液為5%。在此梯度條件下，沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸均能得到較好的分離、峰形良好、保留時間穩(wěn)定。6種酚酸標準品色譜圖見圖1，西沙諾尼果汁樣品色譜圖見圖2。由圖2可以看出，諾尼果汁可同時測出6種酚酸組分，對同一樣品進行多次重復(fù)進樣測定，各組分保留時間穩(wěn)定，保留時間變異系數(shù)小于0.1%，此方法可用于諾尼果汁酚酸的定性、定量分析。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution

圖2 西沙諾尼果汁色譜圖Fig.2 Chromatograms of Xisha noni juice

2.2 線性范圍

用1.2.1配制的沒食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸系列混和標準品溶液，進樣1μL分析，每個濃度標準品重復(fù)進樣3次，以標準品峰面積y對濃度x(mg/mL)進行線性回歸，得到6種標準品的回歸方程，以信噪比(S/N=3)確定方法檢出限見表2。

2.3 精密度試驗

取西沙諾尼果汁(批號20140325)1份，按1.2.2進行樣品制備，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄6種酚酸質(zhì)量濃度，其 RSD值見表3。

2.4 重現(xiàn)性試驗

取同一批西沙諾尼果汁(批號20140325)6份，按1.2.2進行樣品制備，按上述色譜條件進樣分析，測定6種酚酸質(zhì)量濃度，其 RSD值見表4。

表2 6種酚酸組分的回歸方程及檢出限Table 2 Regression equation and detection limit of 6 phenolic acids

表3 精密度測定結(jié)果Table 3 Results of precision test

表4 重現(xiàn)性測定結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

2.5 加標回收率

向已知6種酚酸含量的西沙諾尼果汁(批號20140325)樣品中定量添加標準品的混合溶液，按1.2.2進行樣品制備，重復(fù)6次，根據(jù)測得樣品中6種酚酸的含量分別計算相應(yīng)組分的回收率及標準偏差(RSD)，結(jié)果見表5。

表5 回收率測定結(jié)果Table 5 Results of recovery test

2.6 樣品的測定

取不同批次西沙諾尼果汁，在上述色譜條件下進樣分析，按外標法計算酚酸質(zhì)量濃度。結(jié)果如表6所示，西沙諾尼果汁均檢測到?jīng)]食子酸、龍膽酸、P-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸，不同樣品中酚酸物質(zhì)的含量存在一定差異。這可能與樣品原料諾尼鮮果成熟度及采集期等因素有關(guān)。

表6 西沙諾尼果汁中酚酸含量Table 6 Contents of phenolic acids in Xisha noni juice

3 結(jié)論

本研究建立了一種新型、簡單、同時測定諾尼果汁中6種酚酸的高效液相色譜分析方法。通過對液相色譜條件的選擇和優(yōu)化，6種酚酸在30 min內(nèi)得到了很好地分離且回收率均在91%以上，該方法簡單、實用且準確度較高，重復(fù)性好。

用本文建立的HPLC方法對6批次西沙諾尼果汁中6種酚酸含量進行了測定，結(jié)果顯示西沙諾尼果汁中酚酸主要以P-羥基苯甲酸、綠原酸和龍膽酸為主，其次為咖啡酸和沒食子酸，阿魏酸含量相對較低。6批次西沙諾尼果汁中6種酚酸含量有差異，這可能與諾尼果成熟度、采集期等有關(guān)。而酚酸含量與諾尼果汁品質(zhì)的關(guān)系還有待于今后進一步的研究。

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