朱林江，李崎

1(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫，214122)

L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，但具有重要的生理功能和應用價值，已被應用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領域，包括醫(yī)藥領域的氨基酸輸液和滴眼液，食品領域的飲料添加劑以及化妝品領域的天然保濕因子等。其生產(chǎn)方法有化學合成法、蛋白水解法、酶的生物轉化法、微生物細胞的前體轉化和微生物直接發(fā)酵法等［1］。目前，主要的生產(chǎn)方式是微生物前體轉化，但生產(chǎn)成本偏高，使L-絲氨酸的價格仍保持較高水平，其中醫(yī)藥級的L-絲氨酸價格約為40美元/kg。與其他氨基酸不同，L-絲氨酸是細胞中心代謝的產(chǎn)物，而非典型的代謝途徑末端產(chǎn)物，胞內(nèi)代謝運轉速度較快，其生物制備難度較大。

隨著現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展，特別是代謝工程、合成生物學和基因組工程的快速發(fā)展，人們對工業(yè)微生物的生理和代謝改造能力進一步加強，能夠重構各種化合物的合成途徑，包括氨基酸、有機酸、新型能源化合物以及生物材料等等［2-3］。因此，通過微生物直接利用廉價的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的制備方法重新受到關注。通過實時代謝通量分析，解析了L-絲氨酸中心代謝流的部分特征［4］;通過代謝工程方法，提高了微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的能力，產(chǎn)量達到了35 g/L以上［5-6］。本文從 L-絲氨酸作為中心代謝產(chǎn)物的特征、微生物前體轉化制備方法以及絲氨酸合成途徑的代謝工程改造3個方面闡述其相關研究進展，并探討存在的問題。

1 L-絲氨酸的中心代謝產(chǎn)物特征

許多氨基酸的合成途徑較為復雜，但一般是合成代謝途徑的末端產(chǎn)物，分解途徑較為簡單。而L-絲氨酸的合成途徑剛好相反，如圖1所示。

圖1在微生物細胞內(nèi)的典型L-絲氨酸合成途徑中，合成步驟較為簡單:即葡萄糖經(jīng)過EMP途徑，到關鍵的L-絲氨酸合成前體3-磷酸甘油酸(3-BG)，再通過3步的酶促反應生成L-絲氨酸。這3步反應分別是:①NAD+依賴的3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)催化氧化3-BG生成3-羥磷酸丙酮;②在磷酸絲氨酸氨基轉移酶(PSAT)催化下進行轉氨反應，生成3-磷酸絲氨酸;③最后，由磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP)催化生成L-絲氨酸。這一簡單的合成途徑，同樣存在著典型的氨基酸反饋調(diào)節(jié)機制。如在谷氨酸棒桿菌中［4］，PGDH受到L-絲氨酸的反饋調(diào)節(jié)，其調(diào)控活性中心均位于酶的C-端，與天冬氨酸脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶和蘇氨酸脫氫酶等氨基酸合成代謝途徑中的關鍵酶相似，可通過點突變消除L-絲氨酸的反饋抑制作用。

圖1 胞內(nèi)L-絲氨酸的合成代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serine synthesis in microbial cell

盡管L-絲氨酸的合成代謝途徑較為簡單，但在胞外過量積累的難度卻較大。這是由于L-絲氨酸存在復雜的分解代謝途徑，并參與了胞內(nèi)C-1活性單元的循環(huán)，即屬于胞內(nèi)中心代謝產(chǎn)物。如圖1所示，L-絲氨酸是許多胞內(nèi)化合物合成的前體物，包括甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸等氨基酸，嘌呤、胸腺嘧啶之類的核酸堿基以及磷脂酰絲氨酸(磷脂合成)。通過同位素示蹤實驗證實，若胞內(nèi)過量積累絲氨酸，會迅速地被絲氨酸脫水酶L-SerDH催化生成丙酮酸，進入細胞的主代謝流［7］。此外，絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)與四氫葉酸共同作用，將L-絲氨酸被轉變?yōu)楦拾彼?，此反應為細胞提供了重要的C-1單元化合物N5，N10-亞甲基四氫葉酸。該C-1化合物可進一步轉換為其他活性的C-1單元化合物，包括5-甲基四氫葉酸和10-甲基四氫葉酸。這3種C-1活性化合物參與胞內(nèi)多種重要化合物的合成，包括蛋氨酸、嘧啶、D-泛酸和tRNAfMet。隨后重新被轉化為四氫葉酸，完成1次C-1單元的循環(huán)。由于C-1循環(huán)參與了這些胞內(nèi)重要代謝物的合成，使SHMT的表達是細胞生長所必需的［8］。在E.coli中，通過SHMT的碳代謝流通量被估計占總EMP途徑通量的15%。而在谷氨酸幫桿菌中，流經(jīng)絲氨酸的碳代謝通量占全細胞葡萄糖碳代謝通量的7.5%［9］。所以，L-絲氨酸合成代謝途徑，除了具有典型的氨基酸合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)和支路競爭等之外，同時還為細胞提供重要生物活性的C-1單元，是胞內(nèi)重要的中心代謝產(chǎn)物。所以，L-絲氨酸在胞內(nèi)的代謝運轉速度極快，參與胞內(nèi)C-1單元循環(huán)，部分降解分支途徑不能直接刪除，極大地增加生物法制備L-絲氨酸的難度。

2 L-絲氨酸的微生物前體轉化制備方法

由于L-絲氨酸在胞內(nèi)的中心代謝物特征，通過傳統(tǒng)氨基酸生產(chǎn)菌選育方法難以得到高產(chǎn)菌株，比如用氨基酸結構類似物消除反饋抑制和營養(yǎng)缺陷型菌株篩選等方法，只能選育得到數(shù)克每升合成能力的突變菌株［10］。由此，人們轉向了微生物前體轉化的方法制備L-絲氨酸，即利用SHMT催化反應的逆反應，將較為便宜的前體物如甘氨酸轉變?yōu)榻z氨酸。該逆反應是將外加的甘氨酸和胞內(nèi)活性C-1單元N5，N10-亞甲基四氫葉酸轉變?yōu)榻z氨酸和四氫葉酸。為使微生物細胞實現(xiàn)這種逆反應，并過量積累絲氨酸，需要選育甘氨酸耐受性的菌株，同時能夠利用簡單的C-1單元化合物(如甲醇或甲醛)取代胞內(nèi)合成的活性C-1單元化合物。后來發(fā)現(xiàn)一些甲基營養(yǎng)型細菌具備這種代謝特征，它們的SHMT能夠以外加的簡單C-1單元化合物為底物合成絲氨酸，如一些假單胞菌(Pseudomonas)、石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus)、嗜甲基生絲微菌(Hyphomicrobium methylovorum)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)和白八疊球菌(Sarcina albida)等［6，10］。這些細菌被證實能夠通過乙醛酸循環(huán)和絲氨酸循環(huán)，如圖2所示，吸收胞外的C-1單元化合物作為營養(yǎng)物質(zhì)，合成丙酮酸，提供細胞的生長［11］。所以改造這些甲基營養(yǎng)型細菌，可應用前體物甘氨酸、C-1單元化合物甲醇或甲醛，通過SHMT介導的生物轉換的方法制備L-絲氨酸。

選育的微生物前體物轉化方法生產(chǎn)L-絲氨酸的菌株包括［6］:①假單胞菌3ab，在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中，將甘氨酸轉化為絲氨酸，摩爾轉化率達到50%，絲氨酸產(chǎn)量約7 g/L;②假單胞菌MS31，同樣利用甲醇，通過選育，降低絲氨酸的降解，使產(chǎn)量可達24 g/L;③嗜甲基生絲微菌GM2，利用甲醇，經(jīng)過提高甲醇脫氫酶和SHMT的活性，并結合分批次補料和穩(wěn)定期細胞的發(fā)酵策略，合成了45 g/L的絲氨酸，其甘氨酸的摩爾轉化率為50%［12］;④球形節(jié)桿菌和白八疊球菌，可積累21 g/L的絲氨酸。以上選育的菌株均能直接利用胞外簡單的C-1化合物，L-絲氨酸產(chǎn)量得到了顯著提高，但甘氨酸轉化率并不高，增加了絲氨酸的生產(chǎn)成本。后來選育了1株具有較高轉化率的甲基營養(yǎng)型(Methylobacterium sp.)菌株MN43，利用甲醇，將甘氨酸轉化為絲氨酸的效率接近93%，且能夠合成65 g/L的絲氨酸，具備了良好的生產(chǎn)性能［13］。由于高濃度的甘氨酸會抑制細胞的生長以及絲氨酸在胞內(nèi)降解的不可避免性，由此衍生出了另一種微生物轉化的方法，即利用過量表達了SHMT酶的滲透性細胞或裂解的胞漿，將甘氨酸直接轉化合成絲氨酸，消除L-絲氨酸的降解反應。其典型的例子是產(chǎn)氣克氏桿菌(Klebsiella aerogenes)［14］，通過胞內(nèi)高效過量表達E.coli來源的SHMT，使表達的酶蛋白占細胞總蛋白的10%，并將30 g/L的高密度細胞滲透化或破碎，添加一定濃度的四氫葉酸和甲醛的條件下，高效轉化甘氨酸為絲氨酸，其轉化率達到88%，且絲氨酸產(chǎn)量達到了450 g/L。不過，該方法的原料成本和胞漿制作成本相對較高。隨著分子生物學方法在工業(yè)菌株改造中的廣泛應用，近幾年，針對甲基營養(yǎng)型細菌利用C-1化合物進行生物轉化生產(chǎn)L-絲氨酸的特征，已有遺傳改造的研究報到，即通過表達載體提高胞內(nèi)SHMT表達水平，從而顯著性提高L-絲氨酸的產(chǎn)率［15］;或是篩選不同生物來源的高活性SHMT 酶，如海藻希瓦氏菌［16］和變形假單胞菌［17］，應用于甲基營養(yǎng)型細菌中，提高其L-絲氨酸轉化效率。

3 從糖質(zhì)原料發(fā)酵制備L-絲氨酸

圖2 甲基營養(yǎng)型細菌固定化甲醇和甲醛的絲氨酸循環(huán)和乙醛酸再生循環(huán)Fig.2 Methanol and formaldehyde fixation via the serine cycle and glyoxylate regeneration cycle in methylotrophs

隨著現(xiàn)代生物技術的快速發(fā)展，人們對微生物的改造能力不斷增強，采用低成本的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的微生物直接發(fā)酵法重新受到關注。目前，已通過傳統(tǒng)誘變育種和代謝工程相結合的方法，選育了一些具有工業(yè)應用潛力的L-絲氨酸生產(chǎn)菌株，從葡萄糖或蔗糖直接發(fā)酵合成L-絲氨酸。其中典型菌株包括:①德國的Eggeling課題組通過代謝工程策略，改造谷氨酸幫桿菌的模式菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，成為了1株性能良好的L-絲氨酸生產(chǎn)菌株。其主要策略包括解除了L-絲氨酸合成途徑關鍵酶PGDH的反饋抑制、強化從3-磷酸甘油酸合成絲氨酸的合成途徑、消除絲氨酸脫水酶LSerDH介導的降解途徑和調(diào)節(jié)C-1單元循環(huán)等，最終使谷氨酸棒桿菌在簡單的葡萄糖培養(yǎng)基中，胞外積累35 g/L 以上的 L-絲氨酸［5，18］，也有報道其產(chǎn)量已達到了50 g/L［6］。②由許正宏課題組選育的谷氨酸棒桿菌SYPS-062，該菌株通過多次誘變育種和相似的代謝工程策略，即消除反饋抑制、強化合成途徑、消弱降解途徑等，使該菌株能夠在蔗糖的簡單培養(yǎng)基中，合成25 g/L以上的絲氨酸，但其副產(chǎn)物丙氨酸和纈氨酸積累較高［19-20］。通過發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，產(chǎn)量也已達到30 g/L的水平。③新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物所保藏有1株黃色短桿菌S112(Brevibacterium flavum)，通過誘變育種和遺傳育種相結合，解除了反饋抑制和擴增上游的合成路徑，使該菌株合成絲氨酸的能力達到了18 g/L［21］，具備良好的工業(yè)應用潛力。④其他一些通過代謝工程改造的菌株，包括解除反饋抑制和減弱降解途徑的谷氨酸奉桿菌SER-8［22］和大腸桿菌NW-7［23］，但其 L-絲氨酸合成水平均較低。

以上選育的L-絲氨酸生產(chǎn)菌，主要通過代謝工程方法進行改造，其主要策略包括:(1)消除合成途徑中的反饋抑制。在谷氨酸幫桿菌中，PDGH由serA基因編碼，含有530個氨基酸，其C-端部分序列與催化功能無關，但被證實包含L-絲氨酸的變構調(diào)節(jié)中心。通過刪除第197個氨基酸，可完全消除絲氨酸的反饋抑制，同時不影響催化活性［4］。而在大腸桿菌中，通過改造PDGH的His344和Asn346兩個位點為丙氨酸，可消除絲氨酸的反饋抑制［23］。(2)強化上游的合成途徑，主要是過量表達serB和serC以及經(jīng)過改造serA。(3)消弱L-絲氨酸的降解途徑。主要涉及兩條降解途徑，即絲氨酸脫氫酶(sdaA編碼)催化其轉換為丙酮酸，從而進入主代謝流，通過刪除sdaA可有效地降低絲氨酸的降解速率;通過SHMT酶(glyA編碼)催化其轉化為甘氨酸，由于該酶是細胞生長所必需的，所以通過減弱glyA的表達或采用人工誘導啟動子控制其表達，可有效地阻止絲氨酸的降解，但也會降低細胞的生長速率［18，24］。(4)C-1 單元循環(huán)的調(diào)控。該策略是通過調(diào)控SHMT催化反應中的輔因子四氫葉酸的合成水平，從而有效控制絲氨酸轉化為甘氨酸反應。即通過刪除四氫葉酸合成途徑中的pabAB基因，降低胞內(nèi)四氫葉酸的濃度，使其成為生長的限制性因子，有效地減弱L-絲氨酸的降解速率，使其在發(fā)酵初期便開始積累，提高了生產(chǎn)速率［5，25］。細胞生長所需的四氫葉酸，則以外加葉酸的方式或添加復合發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，如玉米漿等［5］，用于發(fā)酵過程的優(yōu)化控制。這種應用維生素為限制性因子，促進目的代謝產(chǎn)物的積累，已成為代謝工程改造的一個新策略，被應用到其他氨基酸的合成中，如限制泛酸的濃度，提高纈氨酸的合成［26］。

通過以上代謝工程策略，使菌株生產(chǎn)中心代謝產(chǎn)物L-絲氨酸的能力顯著提高。其中，改造中心代謝產(chǎn)物L-絲氨酸合成途徑的特殊策略是以四氫葉酸作為限制性輔因子對其合成進行改造，取代了胞內(nèi)重要代謝酶的調(diào)控，同時刪除了sadA介導的降解分支，不但積累高濃度的絲氨酸，而且保持較好的生長速率。不過，絲氨酸代謝工程改造中仍有存在一些問題亟待解決，比如副產(chǎn)物積累的問題，即部分碳流通過EMP途徑流經(jīng)丙酮酸，從而形成副產(chǎn)物，比如丙氨酸和纈氨酸［27-28］;當胞外糖源濃度下降時，細胞開始利用胞外積累的絲氨酸作為營養(yǎng)物質(zhì)，造成發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛入y以降低到較低水平，不利于工業(yè)生產(chǎn)，所以需要進一步調(diào)控生產(chǎn)菌株降解絲氨酸性能;此外生產(chǎn)菌株的轉化率有待進一步提高。針對以上這些問題，需要我們應用系統(tǒng)生物學技術進一步認識絲氨酸作為中心代謝物在細胞能量代謝、C-1單元活性化合物循環(huán)和其他潛在的合成途徑中所起的作用［29］，更好地解決中心代謝產(chǎn)物積累的技術難題;將系統(tǒng)生物學技術與L-絲氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化相結合，理解溶氧水平、碳代謝流方向以及輔酶平衡等因素對L-絲氨酸胞外積累的影響;同時需要借助最新發(fā)展的高效的基因組工程技術［2］，包括已經(jīng)在谷氨酸棒桿菌中實現(xiàn)了的寡核苷酸介導的多位點基因組同步修飾技術［30］，對生產(chǎn)菌株的基因組進行高效改造;增強菌株利用不同糖質(zhì)原料的能力，包括淀粉、木糖等［31-32］，降低微生物發(fā)酵制備L-絲氨酸的成本。

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