涂行浩，張弘，鄭華，張雯雯，宋國彬，徐涓

1(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，云南昆明，650224)

2(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江，524091)

近年來，瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)作為現(xiàn)代保健品和天然藥物，受到越來越多的國際植物學(xué)專家和醫(yī)藥專家的關(guān)注［1-2］。以瑪咖塊根為主要原料生產(chǎn)的保健酒，可更充分地發(fā)揮其醇溶性功效成分［3-4］的作用，拓展瑪咖產(chǎn)品領(lǐng)域。目前，對瑪咖酒的研究傾向于采用2種方法，一是單獨(dú)浸泡［5］或?qū)斂c其他水果或中藥材(如葡萄、紅景天、枸杞等)配伍浸泡［6-8］，但這種浸泡不能高效提取瑪咖中多種營養(yǎng)和功效物質(zhì)，且產(chǎn)品常有異味;二是將瑪咖同葡萄等高糖含量的水果一同發(fā)酵制酒［9-11］。本研究采用瑪咖單獨(dú)發(fā)酵制酒技術(shù)，以響應(yīng)面法優(yōu)化主要工藝條件，期望能充分保留其芥子油苷、生物堿等特殊功效成分，滿足人體的保健需求并具有果酒的口感，減少和消除異味，為瑪咖資源綜合利用和新產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然干燥瑪咖塊根，由中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所滇中高原試驗(yàn)站提供，用中藥粉碎機(jī)粉碎后過篩。主要成分含量(%):水分6.93、蛋白質(zhì)10.16、總糖 39.98、淀粉 29.16、芥子油苷 1.56、生物堿0.38。

安琪牌活性釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶、糖化酶、鹽酸小檗堿，上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;黑芥子硫苷酸鉀(純度≥99.0%)，Sigma公司;甲醇、乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、溴麝香草酚藍(lán)、CHCl3、無水CaCl2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

DYQ-401B參茸中藥切片機(jī)、中藥粉碎機(jī)，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司;MM400型冷凍混合球磨儀，德國Retsch公司;AB204-S精密型電子天平、HR83-P型快速鹵素水分測定儀，Mettler Toledo中國有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華科技有限公司;Epsilon 1-4中試型凍干機(jī)，德國Christ公司;BCD-539WT冰箱，青島海爾股份有限公司;TY742X2A純水機(jī)，美國Barnstead公司;10～1 000 μL手動(dòng)可調(diào)量程單道移液器，德國Eppendorf公司;EYELA.MTI-201溫度梯度恒溫箱，東京理化器械株式會(huì)社;Z323K通用型高速冷凍離心機(jī)，德國Hermie公司;DU800型紫外-可見光分光光度計(jì)，美國貝克曼庫爾特有限公司;Acme 6100 GC氣相色譜儀，韓國英麟機(jī)器株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 瑪咖發(fā)酵酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

將瑪咖粉加入適量水?dāng)嚢杌靹颍糜趯?shí)驗(yàn)專用微波爐內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理，600 W加熱1 min，取出冷卻，先加入α-淀粉酶液化，60℃、pH 6.0～6.5條件下液化24 h，再加入糖化酶糖化，60℃、pH 4.0～4.5條件下糖化24 h，最后加入活化的釀酒酵母、適量SO2、控溫發(fā)酵8 d。滅菌離心分離得到原酒，將酒液裝瓶后密封于70℃巴氏殺菌20 min，冷藏檢測。

1.3.2 發(fā)酵溫度的確定

在料液比1∶7、酵母添加量0.6%、發(fā)酵至 pH 4.5時(shí)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度20、25、30、35、40℃分別控溫發(fā)酵，測定乙醇產(chǎn)量、芥子油苷浸出率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的發(fā)酵溫度進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.3 料液比的確定

分別選擇料液比 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。對 5 g原料，先后在糊化、液化、糖化和酵母菌接種階段分別加入水(其中糊化階段加10 mL)?？販匕l(fā)酵，測定酒精產(chǎn)量、芥子油苷浸出率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的料液比進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.4 酵母接種量確定

在料液比1∶7、發(fā)酵 pH 4.5、溫度25℃時(shí)，選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%酵母添加量，控溫發(fā)酵，測定乙醇產(chǎn)量、芥子油苷浸出率，從而選擇合適的酵母添加量進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.5 分析測定方法

乙醇含量、總芥子油苷、總生物堿、殘?zhí)菧y定分別采用氣相色譜法法［12］、氯化鈀法［4］、酸性染料比色法［1］、折光糖度計(jì)直接測定法測定。乙醇產(chǎn)量以每100 g干瑪咖粉發(fā)酵產(chǎn)乙醇體積表示。芥子油苷以及總生物堿浸出率分別采用式(1)和(2)計(jì)算:

式中，y1為芥子油苷浸出率;m1為瑪咖發(fā)酵酒中芥子油苷含量;m2為瑪咖粉中芥子油苷含量;y2為總生物堿浸出率;m3為瑪咖發(fā)酵酒中總生物堿苷含量;m4為瑪咖粉中總生物堿含量。

殘余 SO2總量的測定按《GB/T5009.49—2008發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》［13］測定。重金屬、有害微生物的檢測按《GB2758—2005發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［14］測定。酒中游離氨基酸成分分析:取10 mL酒樣，加10 mL 8%磺基水楊酸溶液，并加0.1 g活性炭進(jìn)行脫色處理，充分搖勻，于4℃冰箱內(nèi)靜置2 h，以8 000 r/min 離心 15 min，用 0.45 μm 微孔膜過濾。取透明濾液1.0 mL，用0.1 mol/L HCl稀釋至25 mL，用氨基酸分析儀分析測定［15］?，斂Оl(fā)酵酒感官檢測按《GB15037—2006 葡萄酒》［16］檢測。

2 結(jié)果討論

2.1 各單因素處理對乙醇及芥子油苷含量的影響

2.1.1 發(fā)酵溫度對瑪咖發(fā)酵酒中乙醇和芥子油苷含量的影響

果酒酵母生長繁殖的適宜溫度為22～25℃，一般來說，酵母生長及發(fā)酵的速度隨溫度升高而加快，溫度較高時(shí)，發(fā)酵劇烈、起酵快，但酵母衰老快，反而導(dǎo)致生成酒精質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，揮發(fā)性香氣成分損失較多，且腐敗微生物易在高溫條件下生長發(fā)育，使果酒質(zhì)量下降。此外，果酒酵母不耐高溫，沒有乙醇時(shí)，溫度超過35℃會(huì)影響酵母繁殖，在40～45℃條件下1 h即可致死，而在含有10%乙醇的條件下，致死溫度僅為30℃［17］。如圖1所示，瑪咖發(fā)酵酒乙醇產(chǎn)量，隨發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，25℃時(shí)達(dá)到最高;由圖1中芥子油苷含量的變化趨勢可見，25℃時(shí)乙醇產(chǎn)量也達(dá)到最大值，且此時(shí)芥子油苷浸出率也較高。溫度繼續(xù)升高，芥子油苷浸出率上升趨勢不明顯，故選擇發(fā)酵溫度25℃為中心點(diǎn)，20～30℃區(qū)間進(jìn)行優(yōu)化較為合適。

圖1 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量及芥子油苷浸出率的影響Fig.1 The effect of the temperature on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.1.2 料液比對乙醇和芥子油苷含量的影響

料液比對乙醇和芥子油苷含量的影響如圖2所示?，斂Оl(fā)酵酒乙醇產(chǎn)量隨料液比的增加而增加，但超過1∶7后，乙醇產(chǎn)量增加趨勢不明顯，料液比的增加稀釋了溶液濃度，從而導(dǎo)致體積分?jǐn)?shù)下降較明顯。芥子油苷既是醇溶性物質(zhì)，也是水溶性物質(zhì)，料液比增加在總體上有利于芥子油苷的溶出。由圖2可知，隨著料液比的增加，芥子油苷浸出率一直呈上升趨勢，料液比為1∶7時(shí)，芥子油苷浸出率能達(dá)到57.1%。在乙醇產(chǎn)量較高的情況下，兼顧考慮芥子油苷浸出率與瑪咖發(fā)酵酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)，綜合選擇料液比為1∶7為中心點(diǎn)，在料液比1∶5 ～1∶9進(jìn)行優(yōu)化較為合適。

圖2 料水比對乙醇產(chǎn)量、芥子油苷浸出率以及乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 The effect of the content of yeast on ethanol volume fraction and glucosinolates

2.1.3 酵母添加量對乙醇和芥子油苷含量的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)隨酵母添加量的增加而增加，當(dāng)酵母添加量增加到0.8%以后，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加趨于平緩。這是因?yàn)榻湍改苁固峭耆l(fā)酵，酵母添加量增加則糖的發(fā)酵量也相應(yīng)增加。但由于含糖量有限，當(dāng)完全發(fā)酵后，繼續(xù)增加酵母添加量，乙醇含量也不再增加。由圖3中芥子油苷含量變化趨勢可見，酵母添加量為0.8%時(shí)乙醇含量達(dá)最大，而此時(shí)芥子油苷含量也處于較高水平，綜合乙醇含量及芥子油苷含量，選擇酵母添加量0.8%為中心點(diǎn)，在0.4%～1.2%進(jìn)行優(yōu)化最佳。

圖3 酵母添加量對乙醇體積分?jǐn)?shù)及芥子油苷浸出率的影響Fig.2 The effect of the content of yeast on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.2 瑪咖發(fā)酵酒工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 瑪咖發(fā)酵酒條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-expert 7.1.3軟件，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以影響瑪咖發(fā)酵酒的3個(gè)主要因素發(fā)酵溫度、料液比和酵母添加量為響應(yīng)變量(分別用A、B和C來表示)，乙醇產(chǎn)量及芥子油苷浸出率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表 1［18］。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels for RSM

2.2.2 工藝模型建立及其顯著性檢驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件，按CCD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)，以乙醇產(chǎn)量和芥子油苷浸出率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，以期望得到瑪咖發(fā)酵酒最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

將所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以瑪咖發(fā)酵酒乙醇產(chǎn)量及芥子油苷含量為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸方程，結(jié)果見表3。由表3可知，得到的2個(gè)數(shù)學(xué)擬合模型Y1和Y2的R2值分別為0.984 3和0.932 2，其值均接近1，表明模型與試驗(yàn)擬合度較好，結(jié)果具有較高的可靠性，可用于分析和預(yù)測瑪咖發(fā)酵酒工藝中乙醇產(chǎn)量和芥子油苷浸出率。

為檢驗(yàn)方程的有效性，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析(表4)。從表4回歸方程系數(shù)檢驗(yàn)可以看出，各發(fā)酵因素的改變對2個(gè)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是各因素存在交互作用的影響，如乙醇產(chǎn)量模型的一次項(xiàng)B、C極顯著，而A顯著;交互項(xiàng)AB、AC顯著，BC不顯著;二次項(xiàng)A2、C2極顯著，B2顯著。芥子油苷模型的一次項(xiàng) A、B、C均極顯著;交互項(xiàng)AB、AC 顯著，BC 不顯著;二次項(xiàng) B2、C2極顯著，A2顯著。結(jié)合F值的大小，可知影響瑪咖發(fā)酵酒乙醇產(chǎn)量主效應(yīng)關(guān)系為酵母添加量＞料液比＞發(fā)酵溫度;影響芥子油苷浸出率的主效應(yīng)關(guān)系為料液比＞發(fā)酵溫度＞酵母添加量。

表3 瑪咖酒乙醇及芥子油苷含量回歸模型擬合結(jié)果Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 瑪咖酒乙醇及芥子油苷含量方差分析結(jié)果Table 4 Significance test for regression coefficients of the fitted regression model

2.2.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件的確定

根據(jù)回歸方程作出模型的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。圖4較直觀地反映了任何兩因素的交互影響，以及各因素對2個(gè)響應(yīng)值的影響。本實(shí)驗(yàn)主要以酒精產(chǎn)量和功效成分芥子油苷浸出率為響應(yīng)指標(biāo)，討論瑪咖發(fā)酵酒的最佳制備工藝條件，利用Design-expert7.1.3軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件并在圓整條件下進(jìn)行驗(yàn)證。

由圖4結(jié)果可知，發(fā)酵溫度、料液比以及酵母添加量均對瑪咖發(fā)酵酒酒精產(chǎn)量和芥子油苷浸出率有較大程度的影響，且各因素之間有非常明顯的交互作用。由于本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注瑪咖粉中的淀粉和糖質(zhì)成分是否發(fā)酵完全并得到有較高乙醇體積分?jǐn)?shù)和富含芥子油苷成分的保健酒，因此選擇乙醇產(chǎn)量重要性為5，芥子油苷浸出率重要性3，乙醇產(chǎn)量目標(biāo)值為31.58～500的最大值響應(yīng)，芥子油苷浸出率目標(biāo)值為46.9～100的最大值響應(yīng)，預(yù)測得到較佳的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度25.13℃，料液比7.96，酵母添加量9.5 g/L，在此條件下響應(yīng)面模型預(yù)測的瑪咖發(fā)酵酒乙醇產(chǎn)量為40.97 mL/100 g，芥子油苷浸出率為57.69%。

圖4 各因素對乙醇產(chǎn)量及芥子油苷浸出率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plot and its contour plot showing the effect of three factors on alcohol production and leaching rate of glucosinolate

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型預(yù)測值，圓整發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度25.0℃，料液比8.0，酵母添加量9.5 g/L，在該條件下進(jìn)行3次平行確證試驗(yàn)，取平均值。實(shí)際測得的瑪咖發(fā)酵酒酒精產(chǎn)量為41.16 mL/100g，與預(yù)測值相差0.19 mL/100g，芥子油苷浸出率為57.53%，與預(yù)測值相差0.16%，實(shí)際值與預(yù)測值均相差不大，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，證明用響應(yīng)曲面法預(yù)測瑪咖發(fā)酵酒工藝條件是可行的。

2.4 常規(guī)指標(biāo)檢測

經(jīng)檢測，由優(yōu)化工藝條件制得的瑪咖發(fā)酵酒中，芥子油苷含量為0.827 g/L，浸出率為57.53%，生物堿含量為0.192 g/L，浸出率為42.71%，固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.065 g/L，總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6 g/L，總酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.146 1 g/L，干浸出物為20.56 g/L，衛(wèi)生指標(biāo)中游離SO2未檢出，重金屬鉛、汞未檢出，腸道致病菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等未檢出。其中固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高可能是由于瑪咖發(fā)酵酒中其他物質(zhì)溶出，改變了酒的風(fēng)味，同時(shí)使酒樣中固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高?，斂Оl(fā)酵酒中氨基酸種類齊全，共檢測出17種氨基酸(色氨酸未檢測)，氨基酸總量達(dá)到862.01 mg/100 mL，其中脯氨酸的含量非常高，達(dá)到602.52 mg/100 mL。一般在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)，植物體內(nèi)脯氨酸的含量會(huì)顯著增加，在一定程度上反映了植物的抗逆性，可作為植物抗寒育種的生理指標(biāo)［18］，這與瑪咖一般在高寒山區(qū)種植的情況吻合。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，也可能導(dǎo)致其在瑪咖發(fā)酵過程中大量溶入發(fā)酵酒內(nèi)。除脯氨酸以外，其他氨基酸的組成合理，其中必需氨基酸的含量達(dá)到61.27 mg/100 mL，具有抗中樞疲勞作用的3種氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)含量高達(dá)37.89 mg/100 mL。

2.5 感官指標(biāo)

色澤:呈棕紅色，清亮透明;香氣:有瑪咖的特殊風(fēng)味，略帶醇香，無異味，余味悠長;口感:入口平順，略帶酸澀;風(fēng)格:具瑪咖發(fā)酵酒獨(dú)特風(fēng)格。

3 結(jié)論

發(fā)酵前處理:發(fā)酵前對瑪咖粉微波處理后，表面較疏松，細(xì)胞破碎程度較大，以糊化態(tài)存在。有利于淀粉、生物堿、芥子油苷、糖類等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，且采用微波技術(shù)對瑪咖進(jìn)行處理較蒸煮處理時(shí)間短，操作簡單，可有效減少水分蒸發(fā)和功效成分損失，適用于瑪咖發(fā)酵前處理工藝。

瑪咖發(fā)酵酒最佳發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度25℃、料液比1∶8(g∶mL)、酵母接種量0.95%。該條件下所得瑪咖酒的乙醇產(chǎn)量為41.16 mL/100 g，芥子油苷浸出率57.53%、生物堿浸出率42.71%。產(chǎn)品顏色棕紅，清亮透明，酒體協(xié)調(diào)，略帶醇香，具瑪咖特殊氣味，氨基酸組成合理，主要衛(wèi)生指標(biāo)合格，順應(yīng)了現(xiàn)代人提倡適量飲用低度營養(yǎng)發(fā)酵酒的健康理念。

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