任小娜，陳志梅，曾俊，郭麗君，王玉濤

1(喀什師范學(xué)院生物與地理科學(xué)系，新疆喀什，844006)

2(喀什師范學(xué)院葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什，844006)

原花青素是廣泛存在于植物中的一類天然多酚類化合物，具有水溶、無毒、無過敏、安全性好等特性，是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，其抗氧化效果約為VE的50倍，VC的20倍，而且還有抗衰老、抗腫瘤、抗癌變、預(yù)防心腦血管疾病、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等生理功能［1-4］。目前國際上還沒有統(tǒng)一的原花青素檢測(cè)方法，其定量分析常用比色法，應(yīng)用較多的是香草醛法。

黑果枸杞是茄科枸杞屬的多年生耐鹽、抗旱植物，廣泛分布于我國陜西北部、內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅、青海、新疆和西藏等省區(qū)［5］。其成熟漿果中富含多種天然類多酚色素物質(zhì)［6］。對(duì)黑果枸杞中的原花青素進(jìn)行研究開發(fā)，不僅可以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且對(duì)西部地區(qū)優(yōu)勢(shì)特色植物資源開發(fā)有著積極的促進(jìn)作用。目前關(guān)于黑果枸杞中原花青素的研究報(bào)道較少。因此本文對(duì)黑果枸杞中原花青素的提取方法進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并對(duì)不同產(chǎn)地的黑果枸杞中原花青素的含量進(jìn)行了測(cè)定比較。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

4種黑果枸杞，分別產(chǎn)自青海柴達(dá)木盆地、新疆精河縣、新疆塔什庫爾干縣和甘肅民勤縣，寧夏中寧縣紅果枸杞。5種枸杞均為2013年采摘的成熟期果實(shí)，采摘后，放入烘箱中105℃干燥處理并粉碎，分別置于自封袋中低溫避光保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司;SHA-C電熱恒溫水浴振蕩箱，江蘇金壇億通電子有限公司;FA2204N電子天平，上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

兒茶素標(biāo)樣，購自中國食品藥品鑒定研究所;無水乙醇，香草醛，濃鹽酸均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素的提取方法

稱取一定量已粉碎好的黑果枸杞粉末，按照浸提液乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、萃取反應(yīng)時(shí)間(min)、萃取溫度(℃)、料液比(g∶mL)優(yōu)化提取條件，于恒溫振蕩箱中振蕩萃取，反應(yīng)結(jié)束后，取1 mL定容好的溶液，加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL濃HCl，充分混勻后，立即在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值［7］，并做空白試驗(yàn)。每個(gè)處理平行試驗(yàn)2次，計(jì)算平均值。

1.3.2 原花青素檢測(cè)方法

采用濃HCl-香草醛法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算原料中原花青素的含量。測(cè)定原理:原花青素和兒茶素類單體的A環(huán)的化學(xué)活性較高，在酸性條件下，其上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮和，產(chǎn)物在濃酸作用下形成紅色的正碳離子，樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān)，在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸收光值［8］。由于吸光值與原花青素的含量呈正比，因此，在最佳提取工藝的選取中，以吸光值的大小來衡量原花青素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素的最佳提取工藝研究

2.1.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液30 mL，在50℃恒溫水浴震蕩箱中振蕩2 h，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液的吸光值的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，提取液的吸光值逐漸增大然后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取液的吸光值最大。根據(jù)有機(jī)溶劑“相似相溶原理”，原花青素的溶出度與溶劑的極性和本身的極性相關(guān)，極性相似可達(dá)到最大溶出度。因此選擇最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.1.2 不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液30 mL，在50℃恒溫水浴振蕩箱中振蕩反應(yīng)，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取液吸光值的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的吸光值逐漸增大。在0～10 min，吸光值迅速增加，在10～30 min，吸光值略有上升。在反應(yīng)30 min時(shí)，提取液的吸光值達(dá)到最大，為0.768，30 min后，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，提取液的吸光值趨勢(shì)趨于平緩。時(shí)間過短原花青素不能充分提取，時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致原花青素酚羥基結(jié)構(gòu)破壞，影響提取率，且又不夠經(jīng)濟(jì)。為了充分提取出原料表面及內(nèi)部的原花青素，提高原花青素提取率，選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

2.1.3 不同的反應(yīng)溫度對(duì)提取液吸光值的影響

分別稱取等量黑果枸杞粉末，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液30 mL，于恒溫水浴震蕩箱中振蕩30 min，研究不同反應(yīng)溫度對(duì)提取液吸光值的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，提取液的吸光值先增大然后略有降低，在50℃時(shí)達(dá)到最大值。一方面，隨溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，其滲透、溶解和擴(kuò)散速度加快，因此原花青素浸出速度加快，提取率增加;另一方面，原花青素為熱不穩(wěn)定物質(zhì)，高溫會(huì)使原花青素氧化破壞，穩(wěn)定性減弱，高溫下提取液的吸光值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［9］。因此選擇最佳的反應(yīng)溫度為50℃。

2.1.4 不同的料液比對(duì)提取液吸光值的影響

以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液作提取溶劑，在50℃恒溫水浴振蕩箱中萃取反應(yīng)30 min，研究不同的料液比對(duì)提取液吸光值的影響。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后將提取液過濾，然后將濾液稀釋到相同的體積，測(cè)其吸光值，結(jié)果如圖4所示。

當(dāng)料液比達(dá)到特定范圍時(shí)，擴(kuò)散達(dá)到平衡，繼續(xù)增加溶劑量，萃取率也不會(huì)增加。當(dāng)料液比為1∶15時(shí)(g∶mL)，吸光值達(dá)到最大，若再增大料液比，在過濾過程中，就會(huì)增大溶劑與過濾儀器的接觸面積，延長(zhǎng)過濾時(shí)間，從而增加原花青素的過濾損耗。因此，料液比為1∶20(g∶mL)時(shí)，吸光值會(huì)略有降低。

2.1.5 最佳提取工藝確定

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇L9(34)正交安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表1，正交表及極差分析結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Design scheme in the L9(34)orthogonal experiments array

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Arrangement and result analysis of orthogonal experiments

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正交實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作的便捷性和成本的經(jīng)濟(jì)性，最終確定原花青素的提取條件為:反應(yīng)溫度50℃，料液比1∶10(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，萃取時(shí)間40 min。

2.2 不同產(chǎn)地枸杞的原花青素含量測(cè)定

2.2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用60%乙醇水溶液配制濃度為1 mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液，分別取 0、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL，然后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至5 mL，配制成濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 的兒茶素標(biāo)樣，各取1 mL(體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為空白)，分別加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL濃HCl，充分混勻后，立即在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，得到的回歸方程為:y=4.073 7x+0.003 2，R2=0.998 2。

2.2.2 不同產(chǎn)地枸杞中原花青素的含量

根據(jù)確定的原花青素最佳提取條件，對(duì)4種不同產(chǎn)地的黑果枸杞(青海、新疆精河、新疆塔縣、甘肅)和寧夏紅枸杞中原花青素進(jìn)行提取，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計(jì)算枸杞中原花青素的含量(見表3)。

由表3可知，不同品種枸杞中原花青素含量差別很大，寧夏紅枸杞中原花青素含量?jī)H為0.18%，是甘肅黑果枸杞原花青素含量的1/7，是塔縣黑果枸杞原花青素含量的1/17;產(chǎn)自不同地域的黑果枸杞中原花青素含量差別也較大，范圍為1.21% ～2.99%，其中含量最低的是甘肅黑果枸杞，略低于新疆精河黑果枸杞中原花青素含量，而產(chǎn)自于新疆塔縣黑果枸杞的原花青素含量最高，為2.99%。這可能與物種自身特性和海拔高度、日照時(shí)間等生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，從而導(dǎo)致的枸杞中原花青素含量的地域差異性，今后還有待進(jìn)一步研究。

表3 不同產(chǎn)地枸杞中原花青素的含量Table 3 The contents of procyanidins of Lycium barbarum from different producing area

3 結(jié)論

(1)以原花青素提取液的吸光值大小為衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)確定了黑果枸杞中原花青素的最佳提取條件:反應(yīng)溫度50℃，料液比為1∶10(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，萃取時(shí)間40 min。

(2)采用濃HCl-香草醛法對(duì)4種不同產(chǎn)地的黑果枸杞和寧夏紅枸杞中原花青素的含量進(jìn)行測(cè)定，其中寧夏紅枸杞中原花青素含量最低，僅為0.18%，不同產(chǎn)地黑果枸杞中原花青素含量為1.21%～2.99%，塔縣黑果枸杞中原花青素含量最高，為2.99%。

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