沈喜 朱景紅 浦銅良 易靜 向云 張華 馮虎元

摘要：近年高校的發(fā)展中，實(shí)踐教學(xué)的加強(qiáng)和綜合素質(zhì)的培養(yǎng)已經(jīng)成為當(dāng)前大學(xué)教育改革的重點(diǎn)。分子生物學(xué)作為一門(mén)實(shí)踐性較強(qiáng)的學(xué)科，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等各方面的優(yōu)化改進(jìn)，將基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與科研應(yīng)用和專(zhuān)業(yè)發(fā)展前沿緊密結(jié)合。在提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的同時(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維，促進(jìn)學(xué)生發(fā)揮主觀能動(dòng)性，不斷提高實(shí)踐和創(chuàng)新能力，這也為學(xué)生后續(xù)的工作和科研打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)教學(xué);分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn);優(yōu)化設(shè)計(jì);綜合能力

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.0 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? 文章編號(hào)：1674-9324（2015）24-0251-02

分子生物學(xué)是一門(mén)實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的自然學(xué)科，從分子水平闡述生命活動(dòng)的規(guī)律、揭示生命的本質(zhì)，逐步廣泛地應(yīng)用于生命學(xué)科的各個(gè)領(lǐng)域。從實(shí)踐意義上來(lái)說(shuō)，其實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)提高學(xué)生的綜合素質(zhì)、培養(yǎng)創(chuàng)新精神與實(shí)踐能力有著理論教學(xué)不可替代的特殊作用。這就對(duì)高校教師如何從基礎(chǔ)教學(xué)入手，有效引導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用基礎(chǔ)理論知識(shí)，不斷提高發(fā)掘、探索和解決科學(xué)問(wèn)題的能力提出了更高的要求。

下面，就以本實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中一個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)——“western blotting檢測(cè)人血清IgG”為例來(lái)探討如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，達(dá)到提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、培養(yǎng)科研思維的目的。

一、實(shí)驗(yàn)中待優(yōu)化的問(wèn)題

Western Blotting（蛋白質(zhì)免疫印跡法）是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)常用來(lái)定性地研究目的蛋白的分子量，或者定量檢測(cè)目的基因蛋白水平的表達(dá)[1]。

在本實(shí)驗(yàn)的課程安排中，采用Western Blotting技術(shù)來(lái)定性地研究人類(lèi)血清的主要抗體成分——IgG的相對(duì)分子質(zhì)量。雖然經(jīng)過(guò)幾年的實(shí)踐，該實(shí)驗(yàn)效果良好，但是發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中仍存在以下值得優(yōu)化的問(wèn)題：第一，通過(guò)實(shí)驗(yàn)只能獲得目的蛋白IgG的相對(duì)分子量;由于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容未深入到定量實(shí)驗(yàn)，無(wú)法了解免疫球蛋白在人體不同免疫狀態(tài)下表達(dá)量的差異，一則不符合科學(xué)研究的思路，二來(lái)沒(méi)有打開(kāi)提出問(wèn)題的空間以提高學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。第二，采用普通Marker電泳，當(dāng)電泳結(jié)束后通過(guò)染色、脫色PAGE膠才能顯出各標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶，并且凝膠中的條帶無(wú)法直接轉(zhuǎn)移到NC膜上。所以，計(jì)算目的蛋白的分子量是根據(jù)A圖按照標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白的各相對(duì)遷移率畫(huà)出蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1），根據(jù)B圖免疫印跡結(jié)果求得目的蛋白分子量的相對(duì)遷移率，然后帶入A圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最終求得目的蛋白的相對(duì)分子量。但是由于A圖PAGE膠和B圖NC膜的膨脹系數(shù)不同，學(xué)生計(jì)算過(guò)程中經(jīng)常因蛋白遷移率的測(cè)量誤差，導(dǎo)致求得的目的蛋白相對(duì)分子量存在系統(tǒng)誤差。

二、優(yōu)化措施

針對(duì)以上問(wèn)題以及提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)興趣的目的，我們對(duì)該實(shí)驗(yàn)采取了以下優(yōu)化手段。

（一）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)的優(yōu)化

改變過(guò)去僅僅采用單一正常人血清作為樣本，計(jì)算目的蛋白相對(duì)分子量的定性實(shí)驗(yàn)性質(zhì)，而是進(jìn)一步以正常人血清為對(duì)照，采用各種病例樣本材料，定量分析不同病理狀態(tài)下目的蛋白的表達(dá)含量的變化，將實(shí)驗(yàn)性質(zhì)優(yōu)化為定量實(shí)驗(yàn)（圖2）。

①標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品;②正常人血清樣品;③急性肺炎患者血清樣品;④急性淋巴性白血病患者血清樣品。

（二）實(shí)驗(yàn)材料的優(yōu)化

換用預(yù)染Marker：預(yù)染Marker在電泳分離過(guò)程中，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的條帶直接顯色，可以讓學(xué)生觀察到條帶逐漸分離的過(guò)程，形象而直觀。另外，預(yù)染Marker的條帶可以直接轉(zhuǎn)移到NC膜上，當(dāng)獲得目的蛋白的免疫印跡條帶后，可以在同一張NC膜上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和目的蛋白相對(duì)分子量的計(jì)算，減少了系統(tǒng)誤差，使蛋白質(zhì)分子量的計(jì)算更為準(zhǔn)確。

（三）實(shí)驗(yàn)報(bào)告形式的改進(jìn)

以論文的形式書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告：本實(shí)驗(yàn)面向大二學(xué)生，他們習(xí)慣了實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)模式，要求他們學(xué)習(xí)按照論文的格式，查閱中文文獻(xiàn)，了解“western-blotting”這項(xiàng)技術(shù)在研究蛋白性質(zhì)和功能方面的應(yīng)用，在實(shí)踐中獲得的結(jié)果如何處理分析，并通過(guò)文獻(xiàn)引用來(lái)支持自己的分析，有理有據(jù)。

三、優(yōu)化效果

（一）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)的優(yōu)化，將一個(gè)定性實(shí)驗(yàn)深入到定性加定量的實(shí)驗(yàn)

與科研課題相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)新模式，可以增加實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)的實(shí)用性、多樣性和先進(jìn)性[2]。最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得人血清IgG的相對(duì)分子量，但還沒(méi)有充分發(fā)揮“western-blotting”這項(xiàng)技術(shù)的作用。在科研工作中，經(jīng)常采用本項(xiàng)技術(shù)研究同一種蛋白質(zhì)在生命體不同時(shí)期、不同誘導(dǎo)或脅迫條件、不同免疫等條件下表達(dá)含量的變化，所以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同病理狀態(tài)的血清樣本，有助于幫助學(xué)生進(jìn)一步了解本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的用途，加強(qiáng)基本實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練。

（二）因勢(shì)利導(dǎo)，誘發(fā)學(xué)生發(fā)掘和提出問(wèn)題，加深實(shí)驗(yàn)印象

愛(ài)因斯坦指出：“提出一個(gè)問(wèn)題往往比解決一個(gè)問(wèn)題更重要?！痹诳茖W(xué)研究中，往往解決一個(gè)問(wèn)題也許僅需要實(shí)驗(yàn)技能而已，而能夠提出新的問(wèn)題，才會(huì)演變成探索與創(chuàng)新的動(dòng)力。為了誘導(dǎo)學(xué)生提出問(wèn)題、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)原理的理解和實(shí)驗(yàn)安全操作意識(shí)，我們?cè)谶x擇實(shí)驗(yàn)樣本的時(shí)候，使用了肺炎患者的血清。第一時(shí)間讓學(xué)生提出了疑問(wèn)：使用這種具有一定傳染性疾病患者的血清為實(shí)驗(yàn)材料，會(huì)有傳染危險(xiǎn)嗎？吸引學(xué)生關(guān)注SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)樣品煮沸變性的處理方法。這種處理材料的方法不僅高溫滅活了細(xì)菌，并且在還原劑巰基乙醇的作用下，使蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)活性喪失，完整的蛋白質(zhì)被解聚為亞基或多肽鏈。這樣就進(jìn)一步幫助學(xué)生理解了變性和非變性蛋白電泳在科研中的不同應(yīng)用。

（三）合理選用實(shí)驗(yàn)材料，研討式教學(xué)，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合科研思維

實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)于提高學(xué)生動(dòng)手操作能力、獨(dú)立思考能力和分析、解決實(shí)際問(wèn)題的能力等方面都具有重要的促進(jìn)作用[3]。通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生掌握實(shí)驗(yàn)基本操作僅僅是基礎(chǔ)，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、科學(xué)合理地解釋問(wèn)題是重要的目的。所以在實(shí)驗(yàn)材料的選取中，首先，應(yīng)設(shè)置正常人的樣本為陽(yáng)性對(duì)照，幫助學(xué)生建立生物實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照的重要觀念。其次，選擇不同的病例樣本，以免疫印跡的結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照作對(duì)比，引導(dǎo)學(xué)生驗(yàn)證在感染狀態(tài)和免疫缺陷條件下同一種免疫球蛋白表達(dá)量的變化。最后，細(xì)化樣本亞型的設(shè)置，進(jìn)一步引導(dǎo)學(xué)生研究感染不同時(shí)期的表達(dá)量有何變化，不同亞型白血病的表達(dá)量有何差異，等等問(wèn)題，初步培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)解決科學(xué)問(wèn)題的方法，并鞏固和加深了解生理學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的知識(shí)。

（四）引導(dǎo)學(xué)生通過(guò)查閱文獻(xiàn)解釋問(wèn)題，逐步培養(yǎng)論文寫(xiě)作能力

在以論文形式撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的過(guò)程中，引導(dǎo)學(xué)生分析和論述自己實(shí)驗(yàn)結(jié)果所說(shuō)明的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)報(bào)告作為多元化考核與評(píng)價(jià)的一種實(shí)施方式，除完成正常的思考題之外，還要求寫(xiě)出自己對(duì)實(shí)驗(yàn)的體會(huì)與反思[4]。學(xué)生通過(guò)回顧和反思提出了一系列問(wèn)題，例如只用IgG重鏈做一抗可以計(jì)算出整個(gè)蛋白質(zhì)的分子量嗎？并且通過(guò)各小組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異以及查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)由于肺炎患者B淋巴細(xì)胞功能較亢進(jìn)，合成的免疫球蛋白增多，而急性淋巴性白血病患者紅細(xì)胞免疫功能受到損害，B淋巴細(xì)胞銳減，等等因素可以判斷血樣不同的采樣時(shí)期及患病亞型。通過(guò)論文中發(fā)現(xiàn)和解決的問(wèn)題，使學(xué)生產(chǎn)生成就感，也強(qiáng)烈地激發(fā)了學(xué)生的科研興趣。

綜上所述，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)本著學(xué)生堅(jiān)實(shí)地掌握實(shí)驗(yàn)的理論知識(shí)、熟練掌握基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作的目的，通過(guò)優(yōu)化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，充分提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，并與科研前沿相結(jié)合，培養(yǎng)學(xué)生通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)將理論與實(shí)踐相結(jié)合，用科研思維去發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析問(wèn)題的能力，已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈喜，易靜.基礎(chǔ)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].蘭州大學(xué)出版社，2014.

[2]崔銀秋，林鳳，祿家輝，周慧，騰利榮.建立與科研課題結(jié)合的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)新模式[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009，28（11）.

[3]宋永臣，楊明軍，劉衛(wèi)國(guó)，王正.本科生專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究探索[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2014，33（2）.

[4]汪朝陽(yáng)，祝鳳榮，張向陽(yáng)，周合兵，黃荔，張德明，馮彬，王輝.實(shí)驗(yàn)報(bào)告在多元化考核與評(píng)價(jià)中的功能[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)與技術(shù)，2008，6（5）.