吳 浩，韓紅娟，任小華，梁 琳

1.四川省醫(yī)學科學院· 四川省人民醫(yī)院 口腔科（成都 610072）；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 藥學部（成都 610072）

成骨類細胞的成骨功能與細胞的生理功能息息相關，其功能表現(xiàn)主要為多種成骨相關蛋白表達的調控［1］，牙根表面的牙骨質中大約含有45%～50%無機物（主要為羥基磷灰石）和50%有機物（主要為膠原及非膠原蛋白）。這些蛋白在正畸矯治引起的牙根吸收與修復平衡中發(fā)揮著重要作用［2］。成牙骨質細胞在細胞特征、功能表達等多方面與成骨細胞有許多共性，大量的實驗研究［3］表明，缺氧能促進成骨細胞內的缺氧敏感基因表達，如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）等，但卻很少見缺氧調控成牙骨質細胞礦化功能的相關報道。本文擬對缺氧環(huán)境下成牙骨質細胞成骨功能的調節(jié)作初步探討，為正畸牙移動提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所使用的細胞為美國華盛頓大學Somerman教授實驗室提供的成牙骨質樣細胞株OCCM－30。相關研究［4］表明，OCCM－30細胞的主要性能完全符合成牙骨質細胞功能特點，是成熟、穩(wěn)定的成牙骨質細胞株體系，能作為研究成牙骨質細胞相關調控功能的模型。

1.2 方法

1.2.1 細胞缺氧模型構建 采用德國Binder三氣培養(yǎng)箱，通過控制N2的輸入量，用傳感器來實現(xiàn)對O2濃度的實時精確控制。將細胞按1×105個／mL接種于中號培養(yǎng)瓶（50mL）內，每瓶2mL，鏡下觀察細胞大部分貼壁后（約12h），將培養(yǎng)瓶轉移至三氣缺氧箱內，當氧氣濃度降至預設濃度時（1～2h），開始計時。缺氧組條件設置：2%O2、5%CO2、93%N2；對照組培養(yǎng)條件：20%O2、5%CO2、75%N2（細胞正常培養(yǎng)條件）。檢測時間點：0、6、12、24、36、48、72h。缺氧完成后按檢測手段分別收集細胞。

1.2.2 RT－PCR檢測 引物由寶生物公司代為合成 及 測 試。ALP 正 向 引 物：5＇－CCCCCCGTGG CAACTCTATCTT－3＇，反向引物：5＇－GTAGTTC TGCTCGTGGACGCCG－3＇。OCN 正 向 引 物：5＇－GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG－3＇，反向引物：5＇－GTCAGCCAACTCGTCACAGT－3＇。BSP 正 向 引物：5＇－CTGAAGAAAAACGGGGTCTTTAAG－3＇，反向引物：5＇－ATTGGAGACGGCGATAGTTC－3＇。PCR反應體系總體積20μL，包括PCR正向、反向引物各0.8μL，SYBR Premix Ex Taq 10μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板2μL。設置好反應條件后，計算機系統(tǒng)自動控制反應并實時檢測，繪制擴增曲線并分析，運用△Ct法來評價實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。采用SNK法、單因素方差分析法（one－way analysis of variance，ANOVA）進行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OCCM－30細胞中ALP mRNA的表達變化

缺氧能顯著誘導ALP mRNA的表達，缺氧后6h，ALP mRNA的表達開始上調，12h達頂峰，此后開始下降，36、48及72h與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 OCCM－30細胞缺氧后ALP mRNA的表達變化

2.2 OCCM－30細胞中OCN mRNA的表達變化

缺氧環(huán)境OCN mRNA表達的調控表現(xiàn)為先促進后抑制，隨著缺氧的開始，OCN mRNA的表達逐步上調，在12h達峰值，然后再逐步下降，24、36h與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48、72h表達較對照組低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 OCCM－30細胞缺氧后OCN mRNA的表達變化

2.3 OCCM－30細胞中BSP mRNA的表達變化

總體上來講，缺氧能顯著抑制BSP mRNA的表達，隨著缺氧的開始，BSP mRNA的表達逐步下調，在24、36、48和72h，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但12h時BSP mRNA表達較對照組高，可能是因為在缺氧早期，OCCM－30細胞的數(shù)量在短期內繼續(xù)升高，造成BSP mRNA的相對數(shù)量較高。（圖3）

圖3 OCCM－30細胞缺氧后BSP mRNA的表達變化

3 討論

ALP能代表細胞成骨能力和分化成熟程度，是一類促進鈣離子和無機鹽沉積的促礦化蛋白［5］，廣泛存在于細胞釋放的基質小泡及成骨細胞的表面。在成骨活躍的細胞體系中，ALP的活性普遍增強［6］，因而被認為是成骨活性的代表蛋白之一。成牙骨質細胞與成骨細胞在功能上相似，成骨類細胞表達ALP得到了普遍認可，但由于成牙骨質細胞的特殊性，ALP在成牙骨質細胞中的表達在不同研究中結果存在差異。Grzesik等［7］培養(yǎng)的成牙骨質細胞不表達ALP mRNA或僅有極微量的表達。然而更多的文獻則表明ALP在成牙骨質細胞中的表達與在成骨細胞中相似。Mada等［8］1995年報道在外源性前列腺素E2的誘導下，ALP活性顯著提高，證明外源性前列腺素E2上調ALP的活性及抑制礦化的作用是通過EP4途徑實現(xiàn)的。Bachra［9］則認為，ALP能轉運磷酸基至細胞間質中并降低抑制礦化因子的作用，是細胞分化的前期標志。本研究支持成牙骨質細胞表達ALP。缺氧開始后，ALP mRNA的表達較對照組顯著上調，在12h達峰值，但36h與對照組無差別；OCCM－30細胞缺氧后ALP活性呈現(xiàn)隨時間的起伏變化，在12、36h表達高于對照組，24、48h低于對照組。ALP mRNA在缺氧后的上升是細胞成骨能力在基因轉錄水平的表達，但隨著缺氧時間的延長，細胞整體活力下降，新陳代謝發(fā)生改變，抑制了從ALP mRNA翻譯為蛋白的機制，所以整體上ALP活性在蛋白水平變化不大。

作為骨形成、骨轉化的特征，OCN是一種由成骨細胞合成的廣泛存在于骨基質（骨、牙骨質及牙本質）的非膠原蛋白，在成骨細胞成熟的最后階段（基質礦化）表達。Pearson［10］認為，保持骨正常的礦化速率，防止生成非正常磷灰石，控制發(fā)生礦化的起止邊界是OCN的主要功能，并隨著礦化速率的加快其表達增加。在對成牙骨質細胞的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，OCN的表達量與細胞外礦化程度呈現(xiàn)正相關。Bodine等［11］在1999年的研究指出，OCN通過誘導、活化破骨細胞可以起到調控骨吸收的作用。本研究顯示，OCN mRNA的表達隨著缺氧時間延長而逐步上調，在12h達最高，隨后逐步下調，在24、36h與對照組相比無明顯差異，48h后明顯低于對照組，而OCN蛋白的表達量與mRNA的變化情況相似，在36h達峰值后逐步下降，在時效性上具有延后性。結果提示，短時間的缺氧能刺激成牙骨質細胞的分化及礦化能力的表達，但長時間的刺激能抑制成牙骨質細胞的礦化。

BSP是在牙骨質剛開始形成時高表達的非膠原蛋白，其主要作用是控制磷灰石晶核的生成和發(fā)展。Alford等［12］指出，在牙骨質發(fā)生礦化的過程中，形成的速度越快，所檢測到的BSP含量就越多，BSP與骨橋蛋白（OPN）一起相互作用，在牙骨質的形成中起著不可替代的關鍵作用，其表達區(qū)域主要為牙根的表面。Nanci［13］的研究表明，成熟的成骨樣細胞能分泌高度磷酸化和硫酸化的BSP，同時還能促進其他成骨樣細胞的聚集及黏附，有生理性吸收及修復現(xiàn)象的牙根在反轉線上，BSP的表達非常強烈，這說明BSP能抑制骨基質的吸收并促進礦化開始。本研究發(fā)現(xiàn)BSP mRNA的表達能被缺氧顯著抑制，且呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這符合缺氧能抑制成骨的結論，但12h時BSP mRNA表達增高的原因有待進一步研究。

ALP、OCN及BSP是成牙骨質細胞礦化過程中非常重要的因子，綜合上述三個因子的mRNA表達變化，總體來說，短時間的缺氧能刺激OCCM－30細胞的成骨能力，隨著缺氧時間的延長，成骨功能被抑制。在正畸臨床中，長時間持續(xù)的加力能造成長時間的缺氧環(huán)境，抑制了牙槽骨內的成骨細胞及牙根表面的成牙骨質細胞的生物活性，甚至造成細胞、組織的病理性改變，出現(xiàn)牙根過度吸收，牙槽骨透明樣變化。持續(xù)的重力在正畸矯治過程中不僅不能加快牙移動的速率，反而會造成不良的副作用；相反間斷的輕力能在牙周膜中形成輕微的、短時間的缺氧環(huán)境，可以活化成牙骨質細胞及成骨細胞，既避免了副作用又加快了牙移動的速度。在此觀點上，本研究結果與臨床實踐較為一致。

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