包幸福，倪宇昕，李 瑩，郭小凱，王玉琢，方 蛟，胡 敏

(1. 吉林大學口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長春130021； 2. 吉林大學口腔醫(yī)院種植科，吉林 長春130021)

牙骨質(zhì)是覆蓋在牙根表面的薄層礦化組織，具有錨定牙根和保護牙髓的作用。牙骨質(zhì)在牙根發(fā)育的中晚期開始形成，發(fā)育成熟后一般不進行改建[1-2]。牙骨質(zhì)會在牙根受到壓力或細菌影響時發(fā)生吸收，而在刺激因素消失后進行新生。牙骨質(zhì)發(fā)育和再生的調(diào)控機制尚未完全清楚[3]。Wnt信號通路是一類保守的信號通路的總稱，依據(jù)下游信號分子的不同而被分為Wnt經(jīng)典通路和Wnt非經(jīng)典通路。Wnt家族 5A 蛋白(Wnt5a)是Wnt非經(jīng)典通路的典型激活劑，可以引起下游多種信號分子的活化并發(fā)揮調(diào)控作用[4]。研究[5]顯示：Wnt5a在發(fā)育中的牙囊細胞中呈陽性表達，提示其參與了牙根和牙周組織的發(fā)育活動，但是其表達的具體特點尚不清楚。因此，本研究以牙骨質(zhì)作為研究對象，探討Wnt5a在牙根發(fā)育中的調(diào)控作用，為闡明Wnt非經(jīng)典通路調(diào)控牙發(fā)育的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、主要試劑和儀器 24只SPF級昆明懷孕母鼠購自北京華阜康生物科技公司，動物合格證號：SCXK(京)2014-0004。成牙骨質(zhì)細胞OCCM30由美國華盛頓大學Somerman教授贈送。免疫組織化學試劑盒PV9001(北京中杉金橋公司，中國)，兔抗小鼠Wnt5a多克隆抗體(武漢博士德公司，中國)，DAB顯色試劑盒(福州邁新公司，中國)，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)，總RNA提取試劑盒(北京天根公司，中國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光實時定量試劑盒(TaKaRa公司，日本)。RT-PCR儀(MX3005P，Bio-Rad公司，美國)。

1.2 組織切片制備 以孕鼠分娩時作為實驗起點，選取出生后0.5、4.5、10.5、16.5、20.5、24.5、26.5和30.5 d的小鼠并以此時間點進行分組，每組3只，采用頸椎脫臼法處死后分離下頜第一磨牙和牙周組織。浸泡于4%多聚甲醛溶液中過夜，流水沖洗并進行脫鈣處理，方法如下：將組織塊浸泡于10%乙二胺四乙酸鈉中，于4℃保存1～30 d，以探針能穿透組織作為結(jié)束標準。隨后進行常規(guī)組織脫水和石蠟包埋，利用切片機獲得5 μm厚的組織切片。

1.3 免疫組織化學染色觀察牙根發(fā)育中Wnt5a表達量 按試劑盒說明書進行染色前的切片處理，二甲苯脫蠟，室溫下采用酶消化液孵育10 min；磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次2 min；3%過氧化氫室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次2 min。在組織塊上滴加1∶60稀釋的Wnt5a一抗，并置于4℃冰箱中過夜，次日用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，將試劑盒中的試劑1和試劑2依次滴加到組織塊上，浸泡15 min；磷酸鹽緩沖液沖洗3次后，采用DAB開始顯色反應，流水沖洗結(jié)束反應。采用蘇木素復染并常規(guī)脫水、透明處理和樹膠封片。陰性對照組中將一抗更換為PBS，其他方法一致。顯微鏡下觀察，黃色染色者定義為陽性，無特異染色則為陰性，依據(jù)顏色深淺判斷Wnt5a表達量。

1.4 成牙骨質(zhì)細胞OCCM30的培養(yǎng) 將復蘇后的OCCM30細胞鋪至培養(yǎng)瓶中，于5%CO2和37℃條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液包含DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清，隔天換液。待細胞近75%融合時進行傳代。實驗前將細胞用胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞密度，按每孔6×105個密度接種至6孔板中，次日細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。按處理方式分為實驗組和對照組。實驗組加入終濃度200 μg·L-1重組Wnt5a蛋白，對照組無添加。實驗重復3次。

1.5 RT-PCR檢測 培養(yǎng)24 h后按說明書步驟提取細胞總RNA，測量RNA濃度后進行反轉(zhuǎn)錄獲得DNA，采用RT-PCR進行檢測，所用引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法計算成牙骨質(zhì)細胞中Ocn、Opn、Alp、Bsp、Wnt5a和Runx-2基因相對表達水平。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 牙根發(fā)育中Wnt5a的表達特點 成功地制備了不同出生時間的小鼠磨牙切片，對照組中無陽性染色。出生后0.5 d，磨牙牙胚處于鐘狀期，無Wnt5a陽性表達。出生后4.5 d,小鼠牙胚已經(jīng)初見牙冠形態(tài)，牙釉質(zhì)部分形成，成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞中可見較強的Wnt5a陽性表達，牙乳頭其余部分無陽性表達，此時上皮根鞘剛剛形成。出生后10.5 d,小鼠牙釉質(zhì)和冠部牙本質(zhì)發(fā)育基本完成，成牙本質(zhì)細胞整齊排列在牙本質(zhì)內(nèi)側(cè)， Wnt5a表達量降低，上皮根鞘向根方延伸。出生后16.5 d，牙根發(fā)育完成了2/3，此期牙骨質(zhì)已經(jīng)形成，成牙骨質(zhì)細胞整齊排列在牙骨質(zhì)外側(cè)且Wnt5a呈陽性表達。出生后20.5～30.5 d，牙冠不斷萌出，牙根繼續(xù)發(fā)育，該期間成牙骨質(zhì)細胞中Wnt5a表達量較少，而牙周膜組織中Wnt5a表達量也隨著牙根發(fā)育完成而降低，最終維持在一定水平，牙髓組織中始終未見陽性表達。見圖1～3(插頁一)。

2.2 成牙骨質(zhì)細胞中各基因的相對表達水平 與對照組比較，實驗組成牙骨質(zhì)細胞中Runx-2基因相對表達水平無變化；Wnt5a、Opn和Bsp相對表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Ocn和Alp基因相對表達水平降低超過20%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討 論

牙骨質(zhì)是牙根表面的類似于骨組織樣的薄層礦化組織，成牙骨質(zhì)細胞是形成牙骨質(zhì)的主要細胞。牙骨質(zhì)雖然與骨組織相似，但仍有諸多區(qū)別，如牙骨質(zhì)中無血管和神經(jīng)，因此一般不進行改建。當有正畸力或細菌感染時，牙骨質(zhì)會在破牙細胞的作用下發(fā)生吸收[6-7]；當刺激因素消失后，在牙周膜組織中的成牙骨質(zhì)細胞會向缺損處遷移、黏附，繼而形成新生的修復性牙骨質(zhì)。牙骨質(zhì)的再生對于緩解正畸牙根吸收以及牙周炎均具有重要意義。研究[8-9]顯示：多種信號分子參與了牙骨質(zhì)的發(fā)育和再生過程，如Bmp/Tgfβ通路、Fgf和Hh 通路，但仍有諸多細節(jié)尚未研究清楚。根據(jù)是否需要β連環(huán)蛋白參與，Wnt信號通路劃分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路。研究[10]顯示：Wnt經(jīng)典通路參與了牙根的發(fā)育，如特異性地降低發(fā)育中的成牙本質(zhì)細胞中的β連環(huán)蛋白水平，會造成牙根發(fā)育停止；而采用過表達DKK1降低Wnt經(jīng)典通路水平則會造成牙根發(fā)育過短和牙本質(zhì)缺陷[11]，提示W(wǎng)nt經(jīng)典通路在牙根發(fā)育中的調(diào)控作用。Wnt5a是一種保守的蛋白，在不同類型的細胞中均可以通過不同的細胞表面受體而發(fā)揮不同作用。Wnt5a最常見的細胞表面受體是Frizzled(Fz)，已知Fz3、Fz4、Fz5和Fz8均能與Wnt5a結(jié)合而激活不同的下游分子[12-14]。另一種重要的受體是Ror受體，包括Ror1和Ror2，介導不同的調(diào)控作用[15-17]。關于Wnt非經(jīng)典通路在牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)中作用的報道較少，因而本研究通過動物和細胞實驗，探討Wnt5a在牙骨質(zhì)發(fā)育和分化中的作用，為揭示W(wǎng)nt非經(jīng)典通路對牙骨質(zhì)調(diào)控機制提供依據(jù)。

表2 2組細胞中各基因的相對表達水平

GroupOcnOpnAlpBspWnt5aRunx-2Control1.003±0.0061.003±0.0351.000±0.0361.003±0.0671.007±0.1571.010±0.105Experiment 0.770±0.030* 0.907±0.0050.810±0.078*0.940±0.0610.853±0.1071.000±0.099

*P<0.05vscontrol group.

本研究中出生后0.5 d時小鼠磨牙中Wnt5a無陽性表達；隨著牙釉質(zhì)開始發(fā)育，成釉細胞中開始出現(xiàn)Wnt5a強陽性表達，并在牙冠發(fā)育完成后其表達量降低，直到牙冠萌出，提示W(wǎng)nt5a參與了小鼠出生后牙釉質(zhì)的發(fā)育調(diào)控。研究[18]顯示：牙乳頭中有Wnt5a表達，并抑制牙乳頭細胞的增殖和遷移。本研究中位于牙乳頭外層的成牙本質(zhì)細胞中出生后4.5 d時Wnt5a呈陽性表達，其陽性表達持續(xù)至牙本質(zhì)發(fā)育完成，在出生后30.5 d時小鼠牙本質(zhì)發(fā)育完成后仍維持一定的表達量；而牙乳頭的內(nèi)側(cè)，即牙髓組織中始終未見明顯的Wnt5a陽性表達，牙乳頭中的表達量差異提示W(wǎng)nt5a調(diào)控作用可能具有細胞選擇性。

出生后4.5 d時上皮根鞘形成，標志著牙根和牙周組織的發(fā)育即將開始。在已經(jīng)形成的根部牙本質(zhì)外側(cè)，整齊地排列著成牙骨質(zhì)細胞。直到牙根發(fā)育完成，成牙骨質(zhì)細胞和牙周膜細胞中Wnt5a均呈陽性表達，提示W(wǎng)nt5a在牙囊向牙周組織的分化中起調(diào)控作用，這與之前的研究[19]結(jié)果相近，而在發(fā)育完成后的牙周膜細胞中仍有一定量的Wnt5a表達，因此推測Wnt5a可能在牙周組織穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮作用。

為了進一步分析Wnt5a在牙骨質(zhì)發(fā)育中的作用，本研究培養(yǎng)了小鼠成牙骨質(zhì)細胞細胞系，并在體外分化的培養(yǎng)液中加入了200 μg·L-1重組Wnt5a蛋白，分析有關基因相對表達水平的變化。Runx-2是調(diào)控成牙骨質(zhì)細胞分化最重要的一個基因[20]，Wnt5a并未影響其表達水平。本研究中實驗組細胞Wnt5a基因表達水平降低，說明Wnt5a可能具有自身負反饋調(diào)節(jié)作用，外源性Wnt5a蛋白表達水平升高時會下調(diào)成牙骨質(zhì)細胞的自身表達水平。Ocn、Opn和Bsp均是成牙骨質(zhì)細胞中與鈣離子代謝有關的基因，本研究中三者的表達水平均不同程度降低，提示W(wǎng)nt5a可能主要通過影響鈣離子沉積和羥基磷灰石晶體形成發(fā)揮調(diào)控作用。另一個關鍵指標堿性磷酸酶(ALP)水平的變化也很明顯，重組Wnt5a蛋白降低了ALP的表達水平。研究[19]顯示：外源性Wnt5a蛋白可抑制牙囊向成牙骨質(zhì)細胞的分化。本研究結(jié)果表明：Wnt5a對成牙骨質(zhì)細胞分化可能無明顯作用，而主要通過影響礦化物生產(chǎn)發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，Wnt5a在小鼠磨牙牙骨質(zhì)、牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的不同發(fā)育階段具有獨特的表達特點，其可能對牙體和牙周硬組織的發(fā)育起調(diào)控作用，而對成牙骨質(zhì)細胞的調(diào)控可能是通過影響鈣離子沉積和羥基磷灰石形成而實現(xiàn)的。

[參考文獻]

[1] Foster BL.On the discovery of cementum [J].J Periodont Res,2017,52 (4):666-685.

[2] Yamamoto T,Hasegawa T,Yamamoto T,et al.Histology of human cementum: Its structure,function,and development [J].Jpn Dent Sci Rev,2016,52 (3):63-74.

[3] Li J,Parada C,Chai Y.Cellular and molecular mechanisms of tooth root development [J].Development,2017,144 (3):374-384.

[4] Tamura M,Nemoto E.Role of the Wnt signaling molecules in the tooth [J].Jpn Dent Sci Rev,2016,52 (4):75-83.

[5] Peng L,Ye L,Dong G,et al.WNT5A inhibits human dental papilla cell proliferation and migration [J].Biochem Biophys Res Commun,2009,390 (3):1072-1078.

[6] Iglesias-Linares A,Hartsfield JK Jr.Cellular and molecular pathways leading to external root resorption [J].J Dent Res,2017,96 (2):145-152.

[7] Kinane DF,Stathopoulou PG,Papapanou PN.Periodontal diseases [J].Nat Rev Dis Primers,2017,3:17038.

[8] Li J,Feng J,Liu Y,et al.BMP-SHH signaling network controls epithelial stem cell fate via regulation of its niche in the developing tooth [J].Dev Cell,2015,33 (2):125-135.

[9] Liu Y,Feng J,Li J,et al.An Nfic-hedgehog signaling cascade regulates tooth root development [J].Development,2015,142 (19):3374-3382.

[10]Kim TH,Bae CH,Lee JC,et al.β-catenin is required in odontoblasts for tooth root formation [J].J Dent Res,2013,92 (3):215-221.

[11]Han X L,Liu M,Voisey A,et al.Post-natal effect of overexpressed DKK1 on mandibular molar formation[J].J Dent Res,2011,90 (11):1312-1317.

[12]Kumawat K,Gosens R.WNT-5A signaling and functions in health and disease [J].Cell Mol Life Sci,2016,73 (3):567-587.

[13]Zhou Y,Kipps TJ,Zhang S.Wnt5a signaling in normal and cancer stem cells[J].Stem Cells Int,2017:5295286.

[14]Gibson JD,O’Sullivan MB,Alaee F,et al.Regeneration of articular cartilage by human esc-derived mesenchymal progenitors treated sequentially with BMP-2 and Wnt5a [J].Stem Cells Transl Med,2017,6(1):40-50.

[15]Kobayashi Y,Uehara S,Udagawa N,et al.Regulation of bone metabolism by Wnt signals [J].J Biochem,2016,159 (4):387-392.

[16]Maeda K,Kobayashi Y,Udagawa N,et al.Wnt5a-Ror2 signaling between osteoblast-lineage cells and osteoclast precursors enhances osteoclastogenesis[J].Nat Med,2012,18(3):405-412.

[17]Stricker S,Rauschenberger V,Schambony A.ROR-family receptor tyrosine kinases [J].Curr Top Dev Biol,2017,123:105-142.

[18]Peng L,Ye L,Dong G,et al.WNT5A inhibits human dental papilla cell proliferation and migration [J].Biochem Biophys Res Commun,2009,390 (3):1072-1078.

[19]Sakisaka Y,Tsuchiya M,Nakamura T,et al.Wnt5a attenuates Wnt3a-induced alkaline phosphatase expression in dental follicle cells [J].Exp Cell Res,2015,336 (1):85-93.

[20]Wang YL,He H,Liu ZJ,et al.Effects of TNF-α on cementoblast differentiation,mineralization,and apoptosis [J].J Dent Res,2015,94(9):1225-1232.