李盛楠 李 釩 管修晨 白玉興

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院正畸科 口腔醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050)

甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)是在研究惡性腫瘤引起高鈣血癥機制的過程中分離出的一種多肽類物質(zhì)，因其氨基酸末端與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)相似而得名，兩者具有共同受體甲狀旁腺激素I型受體(parathyroid hormone type I receptor, PTH1R)，并認為PTHrP是PTH調(diào)節(jié)骨形成和骨重建過程中針對局部區(qū)域起效的關(guān)鍵作用物[1]。

PTHrP主要以自分泌、內(nèi)分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)細胞增生和分化，在骨骼發(fā)育、軟骨生成、成骨及破骨等生理過程中起著重要的作用[2]。研究[3-4]顯示PTHrP可以促進成骨細胞或未成熟的成骨細胞增生、分化，有效地增加骨質(zhì)疏松患者的骨密度，加快骨折的愈合，甚至在促進骨形成效能方面已經(jīng)超越PTH。與甲狀旁腺激素相類似，PTHrP對骨組織的代謝也具有雙向調(diào)節(jié)作用[5]。研究[6]顯示，持續(xù)性PTHrP刺激能夠通過激活Notch信號通路促進牙周膜細胞的破牙骨質(zhì)向表達 ，或通過核因子κb受體活化劑配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL) /降低骨保護素(osteoprotegerin，OPG)信號通路抑制成牙骨質(zhì)細胞的礦化及成牙骨質(zhì)向功能活性[7]。但以往研究[5-7]都關(guān)注于PTHrP的分解代謝作用，而間斷性PTHrP對牙周組織影響的研究尚未見報道。

牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的一層礦化組織，成牙骨質(zhì)細胞貼在牙骨質(zhì)表面，是牙骨質(zhì)的功能細胞，促進基質(zhì)沉積，刺激新牙骨質(zhì)生成，在牙齒移動過程中發(fā)揮重要作用，同時直接參與牙根吸收后的修復(fù)。本研究擬通過體外培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30，利用甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PTHrP(1-36)及PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)，探索間斷性PTHrP在調(diào)節(jié)牙骨質(zhì)生成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞

OC-Tag轉(zhuǎn)基因小鼠磨牙牙周組織細胞分離純化的永生化成牙骨質(zhì)細胞株OCCM-30細胞，來自于美國國家衛(wèi)生研究院的Somerman教授贈送。將細胞生長于含10% (體積分數(shù))胎牛血清和雙抗[1%(體積分數(shù))青霉素100 U/mL、鏈霉素 100 μg/mL]的DMEM中，于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱 (德國賀利氏公司)、Real-Time分析儀(美國Applied Biosystems公司)、紫外可見分光光度計(美國NanoDrop公司)。

試劑：Annexin: FITC 凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；BCA蛋白定量分析試劑盒(中國碧云天公司)；real-time PCR引物(日本Takara公司)；COL-1抗體 (美國Abcam公司)；OPN抗體、IGF-1抗體 (美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

主要試劑配制：將PTHrP(1-36) 或PTHrP(7-34)粉劑(美國Bachem公司)以1 mg/mL溶于乙酸中保存于-70 ℃，使用時加入含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，使得PTHrP(1-36)、PTHrP(7-34)終濃度為2.5 nmol/L ，配制含相同體積比例乙酸的DMEM培養(yǎng)基作為對照組。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組與處理

當(dāng)細胞生長密度達到80%～90%時，對細胞進行分組處理：對照組、PTHrP(1-36)組或 PTH1R阻斷劑組。間歇性給藥模式包含3個周期，48 h/周期，每個周期前6 h使用含PTHrP(1-36) 或PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)的培養(yǎng)基，余下42 h換為普通培養(yǎng)基。3個周期結(jié)束后，消化、收集細胞并進行后續(xù)檢測。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測PTHrP對成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30細胞凋亡的影響

對成牙骨質(zhì)細胞給予PTHrP(1-36)、PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激3個周期后，PBS清洗3次，收集細胞。預(yù)冷PBS洗滌細胞2次后，加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL 熒光標(biāo)記的Annexin V，混勻后，加入5 μL 碘化丙啶，混勻后避光室溫下孵育5 min，再加入500 μL結(jié)合緩沖液，轉(zhuǎn)至流式檢測管，立即上流式細胞儀分析。通過相應(yīng)的配套軟件，計算分析各樣本凋亡細胞的百分比。

1.3.3 茜素紅染色觀察PTHrP對成牙骨質(zhì)細胞礦化功能的影響

在對照組、PTHrP(1-36)組和PTHrP(7-34)組培養(yǎng)基中分別添加礦化誘導(dǎo)液(50 μmol 抗壞血酸磷酸鹽和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進行誘導(dǎo)，成牙骨質(zhì)細胞繼續(xù)培養(yǎng)10 d后,經(jīng)95%(體積分數(shù))乙醇固定細胞10 min，雙蒸水洗3次后，0.1%(體積分數(shù))茜素紅溶液(pH值為8.3)染色30 min，干燥，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.3.4 Real-time PCR檢測

收集細胞后進行RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄，real-time PCR反應(yīng)體系包含10 μL SYBR混合物，7.2 μL 滅菌蒸餾水，2 μL cDNA和0.8 μL 引物。進行3次獨立實驗。PCR引物詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.5 Western blotting法檢測

細胞經(jīng)過3個周期處理后，使用預(yù)冷的PBS洗滌細胞。加入細胞裂解液對細胞進行裂解。在4 ℃，14 000 r/min離心20 min，取少量上清至新的EP管中，用于BCA蛋白定量檢測。將等量的蛋白質(zhì)加入到10%(質(zhì)量分數(shù))SDS-聚丙烯酰胺凝膠上通過電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將待測抗體和內(nèi)參按照一定比例用封閉液封閉，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入羊抗兔、羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次。將配好的等體積增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescent, ECL)的兩種液體混合后，顯色，于暗室中進行曝光。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析灰度值，進行3次獨立實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30凋亡的影響

給藥前，對照組、PTHrP組、PTH1R阻斷組凋亡細胞百分比分別為12.6%±1.0%、13.4%±0.6%和12.4%±0.9%，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在間斷性PTHrP(1-36)刺激3個周期后，流式結(jié)果顯示PTHrP組早期和晚期凋亡細胞比例明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相反，在PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激下，成牙骨質(zhì)細胞早期和晚期凋亡的百分比明顯增加，明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30凋亡細胞百分比

2.2 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30礦化功能的影響

成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)OCCM-30細胞的同時分別加入PTHrP(1-36)、PTH1R阻斷劑，間歇性刺激后茜素紅染色結(jié)果顯示PTHrP組礦化結(jié)節(jié)形成增多，更加明顯，茜素紅染色更深。相較于對照組，PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激下礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目更少，茜素紅著色更淺(圖2)。

圖2 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30茜素紅染色

2.3 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1的mRNA表達的影響

與對照組相比，間歇性PTHrP(1-36)給藥刺激后，成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相反，PTH1R阻斷劑組中成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表達明顯下調(diào)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1 mRNA表達變化

2.4 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1的蛋白表達的影響

在3個間歇性PTHrP(1-36)給藥循環(huán)后，Western blotting法檢測結(jié)果顯示成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1蛋白表達均明顯增加(圖4A)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在PTH1R阻斷組，OPN、COL-1和IGF-1蛋白表達水平均受到不同程度的抑制，明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

圖4 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1的蛋白質(zhì)表達水平變化

3 討論

PTHrP在人類及其他多種物種中廣泛表達，通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌的形式作用于各個組織中，參與調(diào)控牙齒、乳腺及心臟血管的發(fā)育[1]。近年來研究[4, 8]顯示甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白能夠有效地促進骨組織的合成，加速骨愈合，表現(xiàn)更優(yōu)于其他促骨組織修復(fù)的藥物 。臨床研究[3-4]發(fā)現(xiàn)對絕經(jīng)后的婦女注射甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PTHrP(1-36)，其骨形成標(biāo)志物骨鈣素和堿性磷酸酶的表達明顯增高，骨密度明顯增加。通過體外研究[9]發(fā)現(xiàn)，間歇性PTHrP能夠刺激成骨樣細胞中COL-1及OCN等成骨相關(guān)蛋白的表達，同時抑制細胞凋亡[10]，進一步促進礦化沉積。此外，以往研究[11]證實牙胚發(fā)育時，成釉器星網(wǎng)狀層細胞和上皮細胞高度表達PTHrP，PTHrP作為一種程序性細胞分化的基因，與牙乳頭細胞表面PTH1R相互作用，調(diào)控牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)的形成，但PTHrP在成牙骨質(zhì)中的作用尚未見報道。

本研究以體外培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細胞OCCM-30細胞為對象，發(fā)現(xiàn)間斷性PTHrP刺激能降低成牙骨質(zhì)細胞中凋亡細胞的百分比，凋亡早期和中晚期細胞比例均有減少，其中凋亡中晚期細胞的減少更加明顯。另外，阻斷PTH1R能誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)細胞的凋亡，說明PTHrP/PTH1R在成牙骨質(zhì)細胞中起到了抑制細胞凋亡的作用。研究[2, 12-13]顯示，間歇性PTH/PTHrP刺激可以抑制骨細胞和成骨細胞的凋亡，促進細胞存活，并發(fā)現(xiàn)PTH和PTHrP的抗凋亡作用一部分依賴于PTH1R，這些結(jié)果與本研究得到的結(jié)果一致。研究[14]顯示，在成骨細胞中PTH1R可以通過與間隙連接蛋白connexin43及磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)相互作用，從而抑制成骨細胞凋亡。但PTHrP/PTH1R在成牙骨質(zhì)細胞中抗凋亡的具體機制仍需進一步研究。

OPN和COL-1是牙骨質(zhì)基質(zhì)初始沉積過程中表達的礦化蛋白，與IGF-1相互作用，能夠促進細胞后續(xù)的黏附、增生及分化，從而有助于形成牙骨質(zhì)[15-16]。研究[17]顯示,在牙骨質(zhì)修復(fù)早期，在陷窩內(nèi)及周圍牙周組織細胞內(nèi)均有OPN及COL-1表達，且OPN在新形成的牙骨質(zhì)層的高表達優(yōu)先于牙周膜細胞，能夠促進成牙骨質(zhì)前體細胞分化及牙骨質(zhì)基質(zhì)礦化。IGF-1通過促進牙周細胞增生、分化等細胞進程，能夠促進牙周組織重建[18-19]。本研究結(jié)果顯示，間歇性PTHrP可促進成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白OPN、COL-1和細胞因子IGF-1基因及蛋白的表達，同時發(fā)現(xiàn)阻斷PTH1R可導(dǎo)致OPN、COL-1和IGF-1基因及蛋白水平下降，說明間歇性PTHrP能夠促進成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白及生長因子表達增加，且這一過程是通過與PTH1R相互作用來完成的，這提示PTHrP/PTH1R信號系統(tǒng)能夠抑制成牙骨質(zhì)細胞凋亡，刺激成牙骨質(zhì)細胞礦化過程，從而加快牙骨質(zhì)的形成及修復(fù)。

與本研究結(jié)果不同的是，既往研究[20-22]顯示，PTHrP促進牙周膜細胞中RANKL及OPG的表達，誘導(dǎo)破骨細胞增加，這種差異可能是由于PTHrP的給藥方式不同導(dǎo)致的。早期研究[23]中PTHrP刺激均為持續(xù)性的給藥方式，并且給藥劑量較大，激活的是PTHrP的促進骨分解代謝的作用，而本研究采用間斷式給藥模式，發(fā)揮PTHrP/PTH1R抗凋亡，促進成牙骨質(zhì)向合成代謝的作用。此外，有研究[24]證實體內(nèi)間斷性注射PTHrP能夠有效抑制糖尿病大鼠牙槽骨的喪失及白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)炎性反應(yīng)因子的表達，從而促進骨組織合成，但PTHrP作用于牙骨質(zhì)的體內(nèi)研究尚未見報道，后續(xù)仍需要相應(yīng)動物實驗進行驗證。

綜上，間斷性PTHrP可通過與成牙骨質(zhì)細胞上PTH1R相互作用抑制細胞凋亡，促進成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白及細胞因子的表達，發(fā)揮其促成牙骨質(zhì)礦化沉積的合成代謝作用，促進牙根吸收的修復(fù)，從而為正畸引起的牙根吸收的預(yù)防和治療提供新的思路。但關(guān)于PTHrP/PTH1R對成牙骨質(zhì)細胞中抑制凋亡和促成牙骨質(zhì)礦化的作用機制，還需進一步的研究。