王 珂，鄒積艷，汪 麗，杜珍武，王俊容，葉 聰，潘 穎

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院研究生管理辦公室，吉林 長春 130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，吉林 長春 130041）

卵巢癌嚴(yán)重威脅女性身體健康，是女性三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于第2位，而其病死率卻高居榜首。卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的5年存活率約為20%［1－2］。卵巢癌的病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［3］，至今仍無特異性的指標(biāo)可以用于卵巢癌的治療和判斷預(yù)后。近年來，腫瘤的基因治療成為熱點。國內(nèi)外已有針對卵巢癌其他基因沉默的類似研究［4－5］，Clark等［6］研究首次明確并證實RhoC在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。以往研究多以質(zhì)粒為載體，轉(zhuǎn)染效率低，本研究應(yīng)用RNAi基因沉默技術(shù)，以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，將組織特異性的RhoC mRNA有效地導(dǎo)入細(xì)胞中，沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞中的致病基因RhoC，抑制RhoC基因與蛋白的表達(dá)，從而使卵巢癌的基因治療成為可能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞均保存于吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院中心實驗室。胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，丙酮酸鈉、非必需氨基酸和Trizol購自美國Invitrogen公司，Lenti－PacTM HIV慢病毒表達(dá)包裝試劑盒購自美國Gene Copoeia公司，兩步法實時熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司。Mx3000P熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司，PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。用于包裝慢病毒的人胚腎293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、1%丙酮酸鈉和1%非必需氨基酸混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，上述2種細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 RhoC基因RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)人RhoC基因cDNA序列（GenBank NO：NM＿001042678.1）設(shè)計RNA干擾的靶序列，根據(jù)靶序列進(jìn)行慢病毒載體構(gòu)建。載體構(gòu)建委托廣州復(fù)能基因生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 慢病毒載體包裝 處于對數(shù)生長期的人胚腎293T細(xì)胞經(jīng)消化重懸后，取1.5×106個細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，2d后將干擾RhoC質(zhì)粒psiHIV－RhoC及陰性對照質(zhì)粒psiHIV－NC分別按病毒包裝說明書進(jìn)行包裝，收集24、48和72h時的上清液。經(jīng)離心、過濾、濃縮后分裝，存放于－80℃條件下備用。所收集的病毒分別為Lenti－shRhoC和Lenti－NC。

1.5 細(xì)胞分組及處理 將SKOV3細(xì)胞按每孔1×105接種于6孔板，分別取1mL濃縮病毒LentishRhoC和通用陰性對照Lenti－NC感染SKOV3細(xì)胞。48h后，倒置熒光顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染Lenti－shRhoC的細(xì)胞為干擾組（2個亞平行組：psiHIV－RhoC1組和psiHIV－RhoC2組），轉(zhuǎn)染Lenti－NC的細(xì)胞為陰性對照組，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的細(xì)胞為空白對照組（SKOV3組）。

1.6 RT－PCR法檢測 SKOV3細(xì)胞中RhoC mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑分別提取干擾組、陰性對照組和空白對照組SKOV3細(xì)胞中RhoC基因的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后采用ABI7500fast熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。按照兩步法實時熒光定量試劑盒SYBR PrimeScript RT－PCR Kit說明書進(jìn)行。PCR引物：RhoC基因上游引物，5′－ACCTGCCTCCTCATCGTCTTC－3′；下游引物，5′－CACCTGCTTGCCGTCCACC－3′；PCR產(chǎn)物片段長度為105bp。GAPDH 內(nèi)參基因上游引物，5′－TGCACCACCAACTGCTTAGC－3′；下游引物，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3′；PCR 產(chǎn)物片段長度為87bp。PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，共40個循環(huán)；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s。RhoC mRNA的表達(dá)水平以2－ΔΔct法計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組SKOV3細(xì)胞中RhoC－mRNA相對表達(dá)量以表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 RhoC基因RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)RhoC基因cDNA序列應(yīng)用RNA干擾設(shè)計軟件，設(shè)定RhoC基因干擾靶向序列為2條，第1條的序列為GACCTGCCTCCTCATCGTC，該序列起始點位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第387位核苷酸；第二條的序列為CGAACCGGATCAGTGC－CTT，該序列起始點位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第776位核苷酸；上述序列分別克隆入慢病毒 psiHIV－H1載體（圖1），分別命名為psiHIV－RhoC1與psiHIV－RhoC2。

圖1 psiHIV－H1載體構(gòu)建圖Fig.1 Diagram of construction of psiHIV－H1vector

2.2 包裝慢病毒載體感染SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)陰性對照組SKOV3細(xì)胞按預(yù)期可見綠色熒光蛋白表達(dá)。經(jīng)病毒感染的psiHIV－RhoC1和psiHIVRhoC2組SKOV3細(xì)胞中亦可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明Lenti－shRhoC慢病毒包裝成功，并能作為干擾載體整合于靶細(xì)胞SKOV3的基因組，而空白對照組SKOV3細(xì)胞中未見綠色熒光蛋白表達(dá)。見圖2（插頁四）。

2.3 各組SKOV3細(xì)胞中RhoC mRNA表達(dá)水平psiHIV－RhoC1組SKOV3細(xì)胞中RhoC mRNA表達(dá)水平（0.006）比空白對照組（1.000）降低，psiHIV－RhoC2組SKOV3細(xì)胞中RhoC－mRNA表達(dá)水平（0.040）比空白對照組降低。見圖3（插頁五）。

3 討 論

RhoC是Rho基因家族中的一員，能夠參與腫瘤細(xì)胞多項重要的生命活動，如調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架、參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖等。其在惡性腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤的遷移和侵襲有密切關(guān)聯(lián)［7－8］。siRNA的生成是RNAi技術(shù)的關(guān)鍵點。體外制備轉(zhuǎn)染效率雖然高，但是極易降解，難以長期發(fā)揮干擾作用。目前常用質(zhì)粒作為載體［9－11］，雖然克服了易降解的缺點，但是轉(zhuǎn)染效率卻不盡如人意。所以本實驗選用了近年來新興的載體—慢病毒，其不易降解，同時轉(zhuǎn)染效率較質(zhì)粒高，能夠穩(wěn)定地在細(xì)胞中發(fā)揮作用，且能作用于哺乳動物，感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，激發(fā)外源基因的表達(dá)，是基因治療比較理想的工具。

本研究采用慢病毒作為載體通過RNA干擾技術(shù)建立了RhoC基因穩(wěn)定低表達(dá)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染psiHIV－Rhoc的SKOV3細(xì)胞中RhoC mRNA的表達(dá)水平較空白對照組顯著降低，這使得卵巢癌的基因治療更具可能性。

綜上所述，本研究通過包裝慢病毒LentishRhoC，建立了慢病毒介導(dǎo)的RhoC基因穩(wěn)定沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，通過實時熒光定量PCR法，證實構(gòu)建的慢病毒載體能夠高效地阻斷卵巢癌SKOV3細(xì)胞中致病基因RhoC mRNA的表達(dá)，為卵巢癌基因治療的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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