魏姍姍，周茂華，李勁高，陳 景，陳少賢，李 倩，夏平方，彭 琪，佘妙容

（1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科，廣東 廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院血液科 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；4.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120；5.廣東省人民醫(yī)院病理生理學(xué)研究室 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一類高度異質(zhì)性疾病，致死率高，盡管目前的治療已大大提高了患者的完全緩解率（complete remission rate，CRR）（50%～75%），但最終仍有超過(guò)60%的患者復(fù)發(fā)死亡。AML患者預(yù)后與初診時(shí)年齡、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)、繼發(fā)性AML、FAB分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)改變等因素有關(guān)聯(lián)，其中細(xì)胞遺傳學(xué)及分子學(xué)改變?nèi)鏔ms樣酪氨酸激酶3／內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（Fms－like tyrosine kinase－3／internal tandem duplication，F(xiàn)LT3／ITD）［1］、核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）［2－3］、Wilms腫瘤易感基因（Wilms tumor type 1，WT1）［4］、t（8；21）和核心結(jié)合因子（core binding factor，CBF）等對(duì)患者預(yù)后尤為重要。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）已依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)改變對(duì)初診AML患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分級(jí)，但有CBF改變的預(yù)后良好患者仍有一半最終復(fù)發(fā)死亡［5］，而FLT3／ITD在不同年齡患者中預(yù)后不同［6］，因此以上因素不能全面準(zhǔn)確地評(píng)估所有患者的預(yù)后，仍需進(jìn)一步探討其他影響患者預(yù)后的因素。白血病難治復(fù)發(fā)的根源是白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSCs）［7－8］，目前公認(rèn)的LSCs免疫表型是CD34＋CD38－型［9－10］，與正常造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSCs）免疫表型一致。國(guó)內(nèi)雖有相關(guān)文獻(xiàn)［11］報(bào)道CD34＋CD38－型細(xì)胞與AML預(yù)后相關(guān)，但未排除年齡和誘導(dǎo)方案等對(duì)患者預(yù)后的影響，中國(guó)AML患者白血病細(xì)胞CD34＋CD38－抗原表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究回顧性分析初診AML患者CD34＋CD38－抗原表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，為指導(dǎo)選擇個(gè)性化、合理化的治療方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2013年11月廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）血液科收治的94例初診AML患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)確診，按FAB分類法分型。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性早幼粒細(xì)胞白血?。∕3）；年齡大于60歲；已接受過(guò)化療或放療；繼發(fā)于骨髓增生異常綜合征或并發(fā)其他骨髓增殖性腫瘤者。納入患者首次誘導(dǎo)治療方案為IA方案。患者表達(dá)CD34＋CD38－抗原者36例，年齡14～60歲，中位年齡為41歲，表達(dá)CD34＋CD38＋抗原者58例，年齡16～60歲，中位年齡為42.5歲。2組患者的性別、年齡、FAB分型、初診時(shí) WBC計(jì)數(shù)大于50×109L－1人數(shù)、WBC計(jì)數(shù)、危險(xiǎn)度分級(jí)和移植人數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。2組患者鞏固治療方案具有一致性。

1.2 化療及支持治療 IA方案：第1～3天靜脈滴注伊達(dá)比星（IDA）8～10mg·m－2·d－1，第1～7天靜脈滴注阿糖胞苷（Ara－c）100～200mg·m－2·d－1。誘導(dǎo)治療部分緩解（partialremission，PR）者繼續(xù)給予IA方案誘導(dǎo)治療1個(gè)療程，未緩解（non－remission，NR）者給予FLAG方案或者CAT方案誘導(dǎo)治療（FLAG方案：第1～5天靜脈滴注氟達(dá)拉濱30mg·m－2·d－1，第1～5天靜脈滴注Ara－c 1～2g·m－2·d－1，滴注時(shí)間為3h，氟達(dá)拉濱用后4h使用，第0～5天皮下注射G－CSF 200μg·m－2·d－1；CAT方案：第1～3天靜脈滴注環(huán)磷酰胺300～500mg·m－2·d－1，第2～6天靜脈滴注 Ara－c 1.0～1.5g·m－2·d－1，第2～6天靜脈滴注拓?fù)涮婵?.25mg·m－2·d－1）。完全緩解（complete remission，CR）者給予4療程大劑量Ara－c鞏固治療（第1、3、5天每12h1次靜脈滴注Ara－c 2.0～3.0g·m－2·d－1），鞏固治療結(jié)束繼續(xù)交替給予NA（米托蒽醌＋Ara－c）、DA（柔紅霉素＋Ara－c）和TA（吡柔比星＋Ara－c）方案序貫治療，有條件行骨髓移植者則行異基因造血干細(xì)胞移植，復(fù)發(fā)患者給予FLAG方案或者CAT方案重新誘導(dǎo)治療。化療同時(shí)給予堿化、水化、輸血和抗感染等對(duì)癥支持治療，化療結(jié)束后第14天行骨髓象復(fù)查。

1.3 主要試劑和儀器 單克隆抗體：鼠抗人CD45PerCP、CD15FITC、CD19FITC、CD7 FITC、CD33PE、CD13PE、CD10PE、CD34 APC、HLA－DR PE、CD117APC、cCD3FITC、CD11bPE、MPO PE、CD79aPE、CD14FITC、CD64FITC、CD56PE、CD38PE、CD123PE和相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)BD公司，紅細(xì)胞裂解液為0.83%氯化銨，洗滌液為含0.5%小牛血清的PBS，固定液為1%多聚甲醛；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá) 取EDTA二鉀抗凝骨髓50μL（約106個(gè)細(xì)胞）注入試管，加入各熒光標(biāo)記的單克隆抗體，室溫避光孵育20min，再向其中加入2mL裂解液，室溫避光放置5～10min，離心棄上清，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入1%多聚甲醛緩沖液0.5mL固定，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）染色：首先加入標(biāo)記的表面抗體，再加入紅細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞10min，離心棄掉上清，加入0.5mL破膜劑室溫破膜5min，PBS洗滌1次，加入MPO PE抗體孵育30min，PBS洗滌，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。每次檢測(cè)前先用CellQuest軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞，用CD45／SSC設(shè)門識(shí)別白血病細(xì)胞群和各有核細(xì)胞群，分析白血病細(xì)胞群在各種分化抗原中的表達(dá)和圖形。其中CD34、CD38抗原的表達(dá)大于20%即為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 療效評(píng)估 主要終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為總生存時(shí)間（overall survival，OS）、無(wú)病生存時(shí)間（disease－free survival，DFS）、1年生存率和2年生存率，次要終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為CRR、總復(fù)發(fā)率和1年內(nèi)復(fù)發(fā)率。療效標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編的第2版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［12］。OS是指患者確診到任何原因出現(xiàn)死亡的時(shí)間間隔。DFS是指患者首次誘導(dǎo)治療完全緩解直至觀察到疾病進(jìn)展或任何原因死亡的時(shí)間間隔（以發(fā)生在先的時(shí)間為主）。1年、2年生存率是指經(jīng)過(guò)治療后，在第1年、第2年尚存活的患者數(shù)所占總?cè)藬?shù)的比例。CR標(biāo)準(zhǔn)：①臨床無(wú)白血病浸潤(rùn)所致的癥狀和體征；②血象，血紅蛋白≥100g· L－1（男），或≥90g·L－1（女），中性粒細(xì)胞絕對(duì)值≥1.5×109L－1，血小板≥100×109L－1，外周血白血病細(xì)胞分類中無(wú)白血病細(xì)胞；③骨髓原始細(xì)胞≤5%。PR標(biāo)準(zhǔn)：骨髓原始細(xì)胞＞5%而≤20%，或臨床癥狀、血象中有1項(xiàng)未達(dá)CR者。NR標(biāo)準(zhǔn)：骨髓象、血象和臨床癥狀均未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)治療獲CR者出現(xiàn)以下情況之一，①骨髓原始細(xì)胞＞5%而≤20%經(jīng)有效抗白血病治療1個(gè)療程仍未達(dá)骨髓象完全緩解標(biāo)準(zhǔn)者；②骨髓原始細(xì)胞＞20%者；③骨髓外白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.6 隨訪方法及時(shí)間 隨訪起點(diǎn)為疾病確診日期，2014年8月1日為隨訪截止日期；隨訪方式為門診或住院復(fù)查記錄；隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀、血常規(guī)和骨髓涂片。本組隨訪率為90.4%，隨訪時(shí)間為1.1～64.9個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為15.6個(gè)月。數(shù)據(jù)截止時(shí)未復(fù)發(fā)或死亡的患者作為刪失值處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。患者年齡、WBC計(jì)數(shù)采用中位數(shù)（M）及最小～最大值（Min～Max）表示；2組患者FAB分型和危險(xiǎn)度分級(jí)組間比較采用Mann－Whitney U 檢驗(yàn)；研究對(duì)象性別、WBC＞50×109L－1人數(shù)、造血干細(xì)胞移植人數(shù)、CRR和復(fù)發(fā)率等計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan－Meier方法描述患者生存曲線。2組患者OS、DFS和生存率比較采用Log－rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者的CRR 共有78例患者達(dá)到CR，其中 CD34＋CD38－組28 例（28／36，77.8%），CD34＋CD38＋組50例（50／58，86.2%），2組患者誘導(dǎo)治療后的CRR比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 2組患者的復(fù)發(fā)率 總復(fù)發(fā)率可評(píng)估患者69例（9例患者失訪），共26例患者復(fù)發(fā)，其中CD34＋CD38－組14 例（14／26，53.8%），CD34＋CD38＋組12例（12／43，27.9%），2組 患者總復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。1年內(nèi)復(fù)發(fā)率可評(píng)估患者74例（2例失訪，2例隨訪時(shí)間低于1年），CD34＋CD38－組復(fù)發(fā)患者9例（9／25，36.0%），CD34＋CD38＋組復(fù)發(fā)患者7例（7／49，14.3%），2組患者1年內(nèi)復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 2組患者中位OS CD34＋CD38－組患者中位OS為13.60個(gè)月，CD34＋CD38＋組中位 OS為20.33個(gè)月，2組患者中位OS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 2組患者中位OS示意圖Fig.1 Schematic diagram of median OS of patients in two groups

2.4 2組患者中位DFS CD34＋CD38－組患者中位DFS為12.87個(gè)月，CD34＋CD38＋組患者中位DFS為33.93個(gè)月，2組患者中位DFS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 2組患者1年和2年生存率 CD34＋CD38－組患者1年和2年生存率分別為52.8%和38.9%，CD34＋CD38＋組患者1年和2年生存率分別為75.9%和48.3%，2組患者1年和2年生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討 論

圖2 2組患者中位DFS示意圖Fig.2 Schematic diagram of median DFS of patients in two groups

圖3 2組患者1年（A）和2年（B）生存率示意圖Fig.3 Schematic diagram of 1－year（A）and 2－year（B）survival rates of patients in two groups

LSCs起源于HSCs，具有HSCs樣自我更新復(fù)制功能，研究［13］顯示：95%LSCs處于G0期，而常規(guī)的化療藥物僅能殺死增殖期LSCs，對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)下的LSCs缺乏殺傷作用，使LSCs得以逃避殺傷，最終導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)，因此LSCs是白血病復(fù)發(fā)的根源。早期Bonnet等［10］發(fā)現(xiàn)：LSCs免疫表型是CD34＋CD38－；本課題組研究［14］亦證實(shí)：高表達(dá)CD34＋CD38－抗原的KG1a細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，可通過(guò)多種機(jī)制抵抗殺傷，因此，初診AML患者高表達(dá)CD34＋CD38－抗原必定造成化療后更多的微小殘留（MRD），而MRD是AML預(yù)后的強(qiáng)有力指標(biāo)，故初診AML患者白血病細(xì)胞表達(dá)CD34＋CD38－抗原可能影響其預(yù)后 。

研究［15－17］顯示：CD34＋CD38－抗原的表達(dá)與小兒AML、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）預(yù)后有關(guān)聯(lián)，表達(dá) CD34＋CD38－抗原者預(yù)后不良。2005年Van Rhenen等［18］提出荷蘭成人初診AML患者白血病細(xì)胞CD34＋CD38－抗原的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)聯(lián)，高表達(dá)CD34＋CD38－抗原者 MRD多，患者預(yù)后差。鑒于不同疾病的預(yù)后可能有種族差異，本研究以中國(guó)人群為研究對(duì)象，納入性別、年齡、FAB分型、初診時(shí) WBC＞50×109人數(shù)、WBC計(jì)數(shù)和危險(xiǎn)度分級(jí)均具有一致性的CD34＋CD38－、CD34＋CD38＋患者進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，2組患者誘導(dǎo)方案均為IA方案。本研究結(jié)果顯示：CD34＋CD38－組患者CRR與CD34＋CD38＋組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果與Zhang等［19］的研究結(jié)果不一致。Zhang等［19］發(fā)現(xiàn)：CD34＋CD38－抗原的表達(dá)與AML患者首次誘導(dǎo)CR有關(guān)聯(lián)，高表達(dá)CD34＋CD38－抗原者化療結(jié)束第7天骨髓幼稚細(xì)胞比例偏高，CRR偏低。本研究誘導(dǎo)方案為IA方案，而Zhang等［19］誘導(dǎo)方案為HAD（高三尖杉酯堿＋Ara－c＋柔紅霉素）、DA、NA、HAA（高三尖杉酯堿＋Ara－c＋阿克拉霉素）或MAC（米托蒽醌＋Ara－c＋環(huán)磷酰胺）方案，而首次誘導(dǎo)方案不同，患者CRR可能不同，故本研究結(jié)果與Zhang等［19］研究結(jié)果不一致可能和其誘導(dǎo)方案不同有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與 Wang等［11］的研究結(jié)果一致，Wang等［11］的研究誘導(dǎo)方案為IA方案和DA方案，納入患者的年齡14～71歲，由于高齡（年齡＞60歲）已作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究納入的患者年齡為14～60歲，本研究進(jìn)一步肯定Wang等［11］的研究結(jié)果，為指導(dǎo)初診AML患者的預(yù)后指標(biāo)提供了依據(jù)。

本研究中CD34＋CD38－組患者總復(fù)發(fā)率為53.8%、1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為36.0%，均高于CD34＋CD38＋組（27.9%和14.3%），與Wang等［11］的研究結(jié)果一致。Wang等［11］研究結(jié)果顯示：白血病細(xì)胞表達(dá)CD34＋CD38－抗原者復(fù)發(fā)率達(dá)47.62%，而表達(dá)CD34＋CD38＋抗原者復(fù)發(fā)率僅為11.1%。目前多項(xiàng)研究［18－20］表明：骨髓白血病細(xì)胞表達(dá)CD34＋CD38－抗原患者的 MRD明顯高于表達(dá)CD34＋CD38＋抗原患者，MRD是監(jiān)測(cè)患者早期復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，MRD越多，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越大，復(fù)發(fā)率越高。此外，Plesa等［21］還發(fā)現(xiàn)：與表達(dá)CD34＋CD38＋抗原者比較，表達(dá)CD34＋CD38－抗原者行自體HSCs移植復(fù)發(fā)時(shí)間早，生存期短。

本研究中CD34＋CD38－組患者中位OS和中位DFS 為 13.60和12.87個(gè)月，明顯短于CD34＋CD38＋組患者（20.33和33.93個(gè)月），此外CD34＋CD38－組患者1年和2年生存率分別為52.8%和38.9%，亦明顯比CD34＋CD38＋組患者（75.9%和48.3%）低，表明白血病細(xì)胞表達(dá)CD34＋CD38－抗原者生存率低于表達(dá)CD34＋CD38＋抗原者。由于耐藥機(jī)制的存在［22－23］，AML復(fù)發(fā)患者再次誘導(dǎo)CRR降低，OS縮短，因此CD34＋CD38－組患者高復(fù)發(fā)率必然導(dǎo)致生存率低，生存時(shí)間縮短。

綜上所述，初診AML患者白血病細(xì)胞表達(dá)CD34＋CD38－抗原提示預(yù)后不良，初診AML患者應(yīng)盡可能行流式細(xì)胞術(shù)檢查骨髓CD34＋CD38－抗原的表達(dá)，并與已知預(yù)后因素相結(jié)合全面評(píng)估患者預(yù)后，其他影響患者預(yù)后的因素也需進(jìn)一步探索。

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