齊 玲，王瑋瑤，張艷春，蔡尚霞，楊寧江，劉曉麗

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，吉林 吉林 132021）

近年來(lái)哮喘的患病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，哮喘已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病，尤其是兒童哮喘的發(fā)生給患兒及家屬帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。研究［1－3］顯示：哮喘的發(fā)生與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）有關(guān)聯(lián)，但研究結(jié)果僅限于對(duì)患者血清TNF－α水平的檢測(cè)，而半胱氨酸蛋白酶8（cysteine containing aspirate specific protease－8，Caspase－8）、受體相互作用蛋白（reportor interacting protein，RIP）、腫瘤壞死因子相關(guān)受體2（TNF receptor－associated factors－2，TRAF－2）和半胱氨酸蛋白酶3（cysteine containing aspirate－specific protease－3，Caspase－3）在兒童哮喘發(fā)病中的作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)不同哮喘發(fā)作狀態(tài)時(shí)患兒血清中TNF－α通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討兒童哮喘的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年1月—2012年1月在北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的33例哮喘患兒，年齡1～14歲，平均年齡（4.8±4.1）歲，其中男性18例，女性15例，患兒診斷均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》［4］。選擇31名正常門(mén)診體檢兒童作為對(duì)照組，其中男性14名，女性17名，年齡1～18歲，平均年齡（5.8±2.9）歲。本研究通過(guò)北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，所有研究對(duì)象均已簽署或由監(jiān)護(hù)人代為簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器 TNF－α、Caspase－8抗體和二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色試劑（美國(guó) Epitomics公司），TRAF－2和Caspase－3抗體（美國(guó)SANTA CRUZ公司），RIP抗體（美國(guó)BD公司）；J－26XP超低溫高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司），超低溫冰箱（MDF－U53V，日本三洋公司），PLUS 384全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MDC公司）。

1.3 ELISA 法檢測(cè) 研究對(duì)象血清中TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白的表達(dá)水平［5］抽取對(duì)照組研究對(duì)象和哮喘患兒不同時(shí)期（急性發(fā)作期、臨床緩解期及慢性持續(xù)期）的外周靜脈血2mL，室溫靜置4h，將上清小心吸至

1.5 mL Eppendorf管中，做好標(biāo)記后置入4℃冰箱中備用。待收集齊血清樣本，設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。取受試者血清，將血清與包被液按1∶1比例包被后4℃過(guò)液。封閉后加入TNF－α、Caspase－8 、TRAF－2、RIP和Caspase－3 抗 體（1∶1000稀釋?zhuān)?，?4℃ 過(guò)夜。次日加入二抗（1∶1000稀釋?zhuān)┦覝叵路跤?h，加顯色液室溫避光顯色。于自動(dòng)酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定吸光度（A）值，用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平ELISA結(jié)果顯示：各期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平均升高。與對(duì)照組比較，哮喘患兒急性發(fā)作期血清中 TNF－α、Caspase－3和Caspase－8蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），臨床緩解期及慢性持續(xù)期血清中Caspase－8蛋白表達(dá)水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），臨床緩解期血清中Caspase－3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而慢性持續(xù)期血清中Caspase－3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，哮喘患兒臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期血清中TRAF2及RIP蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討 論

TNF－α是一種由活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫等多種病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此，有關(guān)TNF－α信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究一直是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。TNF－α和TNF－β雖不同，但其DNA序列同源性可達(dá)56%，氨基酸水平同源性可達(dá)36%，而且兩者作用的受體均為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）。TNFR 有TNFR1和TNFR2兩種形式，均為Ⅰ型跨膜糖蛋白，前者在體內(nèi)的大多細(xì)胞表面均廣泛分布，后者僅局限在免疫細(xì)胞。當(dāng)TNF－α與TNFR1結(jié)合后，與細(xì)胞中TNFR死亡域結(jié)合蛋白（TNFR－associated death domain protein，TRADD）結(jié)合，再與細(xì)胞中Fas相關(guān)死亡域蛋白（Fas－associated with death domain protein，F(xiàn)ADD）和Caspase－8結(jié)合，進(jìn)而激活其下游Caspase－3蛋白，通過(guò)經(jīng)典的凋亡途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡［6－7］。另一方面，TNF－α與TNFR1相結(jié)合后，會(huì)募集TRAF2和RIP，進(jìn)而激活NF－κB信號(hào)通路而發(fā)揮多重生理調(diào)控功能［8－10］。

表1 各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

表1 各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group.

ase－3 TRAF2 RIP Control 31 14.01±0.51 20.34±0.80 1.23±0.07 4.13±0.21 0.77±0.07 Asthma 33 Clinical remission 15.75±0.96 18.12±1.12 1.03±0.09＊ 2.76±0.08 0.71±0.08 Chronic persistent 17.33±0.51 16.11±1.02 1.36±0.21＊ 4.28±0.42 0.79±0.04 Acute exacerbation 19.86±0.76＊ 32.99±5.04＊ 1.40±0.20＊3.77±0.37 0.77±0.16 Group n TNF－α Caspase－8 Casp

國(guó)內(nèi)外關(guān)于哮喘與TNF－α的關(guān)系已有大量臨床血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果來(lái)支持，但具體TNF－α通路在哮喘發(fā)生機(jī)制中如何發(fā)揮作用尚不清楚［11－13］。本研究結(jié)果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平均升高，尤其是急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明哮喘兒童血清TNF－α水平與哮喘的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，與此前研究［1－3］結(jié)果一致。同時(shí)，哮喘患兒處于臨床緩解期和慢性持續(xù)期時(shí)，血清中TNF－α表達(dá)水平升高，提示TNF－α可能全程參與了兒童哮喘的發(fā)生發(fā)展。

急性發(fā)作期哮喘患兒血清中Caspase－8蛋白表達(dá)水平明顯升高，這一結(jié)果與TNF－α表達(dá)規(guī)律一致。說(shuō)明哮喘急性發(fā)作可能通過(guò)激活TNF－α通路，活化細(xì)胞中的Caspase－8蛋白，使之表達(dá)增加，引起凋亡經(jīng)典途徑激活而引發(fā)細(xì)胞凋亡，促使哮喘發(fā)生。Caspase－3是凋亡傳導(dǎo)通路的下游凋亡執(zhí)行蛋白［14－15］，急性發(fā)作期患兒血清中 Caspase－3蛋白表達(dá)水平亦升高。這進(jìn)一步驗(yàn)證了哮喘急性發(fā)作時(shí)TNF－α通路激活，引起細(xì)胞中Caspase－8蛋白活化后繼而激活Caspase－3蛋白，使細(xì)胞凋亡發(fā)生，最終誘發(fā)哮喘。

本研究結(jié)果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TRAF2和RIP蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明TRAF2和RIP蛋白可能不參與TNF－α信號(hào)通路在哮喘中的作用。但由于本實(shí)驗(yàn)患兒例數(shù)較少，不能完全排除該2種蛋白的作用。具體哪種細(xì)胞發(fā)生了凋亡，引起患兒哮喘發(fā)生尚未完全定論，也可能有其他的凋亡傳導(dǎo)通路在哮喘發(fā)生中起作用，但哮喘與TNF－α的關(guān)系還需更多的動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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