楊 易，祁愛(ài)琴，郝秀靜，徐金瑞

（寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

我國(guó)糖尿病患者人數(shù)近1億，其中2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）患者約占95%。遺傳因素與環(huán)境因素共同決定了T2DM的發(fā)生［1－2］。T2DM的主要病理生理改變是胰島素的分泌缺陷和胰島素抵抗［3］，因此與胰島素分泌、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路和胰島β細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因是T2DM發(fā)病機(jī)制研究的重要候選基因。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome－wide association study，GWAS）顯示：轉(zhuǎn)錄因子7類似物2（transcription factor 7like 2，TCF7L2）基因異常表達(dá)與T2DM 的發(fā)生有關(guān)聯(lián)［4－6］。TCF7L2基因又稱T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子4（T cell factor－4，TCF4），位于人類染色體10q25.3，長(zhǎng)度為215.9kb，包括14個(gè)外顯子。其表達(dá)產(chǎn)物是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子，對(duì)胰島β細(xì)胞功能有調(diào)控作用。TCF7L2基因發(fā)生變異最終導(dǎo)致β細(xì)胞功能缺陷，胰島素分泌不足［7］。TCF7L2基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 與T2DM的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)性，但對(duì)不同種族或人群的研究結(jié)果存在差異性［8－10］。rs290487位點(diǎn)位于TCF7L2基因7號(hào)內(nèi)含子上，在10號(hào)染色體上位置為114909731。目前在該位點(diǎn)上的研究沒(méi)有其他位點(diǎn)廣泛，且得出的結(jié)論亦不一致［11］。目前，尚未見(jiàn)TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM關(guān)聯(lián)性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分型方法，對(duì)寧夏回族健康個(gè)體和T2DM患者TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)遺傳統(tǒng)計(jì)分析，旨在揭示該位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)性，以期為寧夏回族人群T2DM的早期預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所用血樣來(lái)源于2011年寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者及體檢者，其中健康者109名（對(duì)照組），T2DM患者111例（T2DM組），年齡30～80歲。個(gè)體間均無(wú)血緣關(guān)系，且3代均為回族，在寧夏回族自治區(qū)居住3代以上。根據(jù)知情同意的原則，采研究對(duì)象的外周靜脈血樣本用于提取基因組DNA。T2DM納入標(biāo)準(zhǔn)參照1999年WHO的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)和1999年10月我國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)的中國(guó)人群T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊類型的糖尿病。

1.2 基因組DNA提取 采用常規(guī)酚／氯仿提取法提取基因組DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中TCF7L2基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增rs290487位點(diǎn)所在目的片段，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列：F，5′－AGGAGGCTGCCATATTGTTTACTT－3′；R，5′－ACACCTTTCTCATTTTCAATTTCGC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為153bp。

1.4 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系20μL，其中DNA模板（40mg·L－1）1.0μL，上下游引物各0.5μL，2 × Reaction Mix 9.5 μL，Golden DNA Polymerase（2.5U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水8.0μL。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min；94°C變性30s，61℃退火30s，72°C延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物3μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 酶切反應(yīng) 在20μL酶切體系中，加入PCR產(chǎn)物6μL，10×酶切緩沖液2μL，限制性內(nèi)切酶（10U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水 11.5μL。37℃水浴酶切6h后，采用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。

1.6 基因型分析 根據(jù)酶切產(chǎn)物判斷個(gè)體基因型，3種基因型對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物分別為T(mén)T：153bp；CT：153bp、128bp和25bp；CC：128bp和25bp。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組與T2DM組研究對(duì)象的基因型和等位基因頻數(shù)分布分析采用Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR反應(yīng)結(jié)果 擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期大小一致，長(zhǎng)度為153bp，且條帶清晰，可用于后續(xù)酶切反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

圖1 rs290487位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR products of rs290487site

2.2 PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)結(jié)果 在對(duì)照組和T2DM組中均檢出3種基因型，分別為T(mén)T、CT和CC。見(jiàn)圖2。

圖2 rs290487位點(diǎn)PCR產(chǎn)物AccⅡ酶切電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR products of rs290487site digested by AccⅡenzyme

2.3 2組研究對(duì)象基因型和等位基因頻數(shù)分布在對(duì)照組和T 2DM組研究對(duì)象中基因型頻數(shù)分布符合 Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝4.021，P＞0.05；χ2＝1.581，P＞0.05），具有群體代表性。見(jiàn)表1。

表1 2組研究對(duì)象rs290487位點(diǎn)基因型頻數(shù)分布的Hardy－Weinberg平衡性檢驗(yàn)Tab.1 Hardy－Weinberg equilibrium test for genotypic frequency distribution at rs290487site of TCF7L2gene

T2DM組和對(duì)照組研究對(duì)象基因型、等位基因頻數(shù)頻數(shù)分布：rs290487位點(diǎn)3種基因型TT、CT和CC在對(duì)照組研究對(duì)象中的頻數(shù)分別為31.19%、40.37%和28.44%，在T2DM組的頻數(shù)分別為24.32%、55.86%和19.82%，基因型頻數(shù)分布組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.370，P＞0.05）；等位基因T和C在對(duì)照組中的頻數(shù)分別為51.38%和48.62%，在T2DM組的頻數(shù)分別為52.25%和47.75%，等位基因型頻數(shù)分布組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.034，P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 2組研究對(duì)象rs290487位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs290487site of objects in two groups ［n（η／%）］

3 討 論

SNPs是基因組變異中最常見(jiàn)的一種形式，在人類基因組中大概每1000個(gè)堿基中就有1個(gè)SNP。不同人之所以對(duì)疾病的易感程度有所區(qū)別，對(duì)藥物會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，部分受到SNP影響。SNP作為第3代遺傳標(biāo)記，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體疾病易感性分析和藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的作用。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同人種TCF7L2基因SNPs位點(diǎn)與T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)性的研究結(jié)果表明：T2DM本身具有高度遺傳異質(zhì)性，不同地區(qū)和不同種族人群的遺傳背景不同，且生活習(xí)慣、環(huán)境因素等方面也有很大差異。TCF7L2基因變異型增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的原因：在胰島β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，Wnt信號(hào)通路異常，導(dǎo)致前胰島素加工障礙，胰島素分泌減少，腸促胰島素的水平下降，肝糖原輸出水平增加，以及胰島淀粉樣蛋白沉積，影響胰島β細(xì)胞功能，并使胰島凋亡增加。

本研究采用PCR－RFLP法對(duì)寧夏回族健康個(gè)體和T2DM患者外周血中TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)。目前已有國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地區(qū)人群TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究。Chang等［12］對(duì)中國(guó)臺(tái)灣漢族人群、Ren等［13］對(duì)中國(guó)漢族人群、邊澈等［14］對(duì)中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)漢族人群的研究結(jié)果均表明：TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。而張勇等［1］對(duì)中國(guó)濟(jì)南地區(qū)人群、紀(jì)紅梅等［15］對(duì)中國(guó)遼寧地區(qū)人群、鄒云蓮等［16］對(duì)中國(guó)昆明地區(qū)漢族人群的研究結(jié)果均表明：TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)。任倩等［17］對(duì)中國(guó)臺(tái)灣、安徽和黑龍江省3個(gè)地區(qū)人群的多態(tài)性研究進(jìn)行薈萃分析，合計(jì)樣本量，使用隨機(jī)效應(yīng)模型選取T2DM患者9422例，正常人8585名，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM發(fā)生有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，TCF7L2基因與T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果在我國(guó)呈現(xiàn)出較強(qiáng)的異質(zhì)性。本研究中TCF7L2基因rs290487位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM發(fā)生未表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性，這是否因樣本量原因所致，還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、充實(shí)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

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