張偉傅溥博高宏偉魏海燕梁新苗劉建禮劉來(lái)福*

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局）

ELISA操作注意事項(xiàng)及不確定度分量分析

張偉1傅溥博1高宏偉2魏海燕1梁新苗1劉建禮1劉來(lái)福1*

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局）

對(duì)ELISA的具體操作過(guò)程進(jìn)行了梳理，討論了操作過(guò)程中的注意事項(xiàng)。根據(jù)測(cè)量不確定度規(guī)范性文件的要求，結(jié)合要素的注意事項(xiàng)對(duì)ELISA檢測(cè)過(guò)程中的不確定度分量進(jìn)行了初步分析。

ELISA；注意事項(xiàng)；不確定度

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）是目前在很多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種試驗(yàn)方法，其基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。依其測(cè)定抗原和抗體的不同，ELISA可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法（直接、間接）、競(jìng)爭(zhēng)抑制法（直接、夾心等）、捕獲法等。在測(cè)定抗原時(shí)，蛋白質(zhì)大分子抗原測(cè)定多用雙抗體夾心法，而只有單個(gè)抗原表位的小分子則常使用競(jìng)爭(zhēng)抑制法；對(duì)抗體的測(cè)定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法和捕獲法等［1］。在實(shí)際操作過(guò)程中，ELISA會(huì)出現(xiàn)一些常見(jiàn)的問(wèn)題，問(wèn)題的產(chǎn)生涉及試劑的選擇、操作流程及不當(dāng)操作等。本研究從ELISA檢測(cè)的常見(jiàn)的問(wèn)題出發(fā)，系統(tǒng)梳理影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素，根據(jù)測(cè)量不確定度規(guī)范性文件的要求與指南的指導(dǎo)對(duì)ELISA測(cè)定中的不確定度分量進(jìn)行了歸納與分析。

2 ELISA檢測(cè)中常見(jiàn)的問(wèn)題分析

ELISA方法具有敏感度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，但此方法操作步驟較多，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、溫度、人員操作有較高要求，試驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)操作環(huán)節(jié)不規(guī)范都會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，得到錯(cuò)誤結(jié)果［2］。

2.1試劑

試劑本身以及在使用過(guò)程中的問(wèn)題都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，造成結(jié)果偏差。如，使用過(guò)期試劑或不同試劑盒組分混用；試劑盒未按規(guī)定保存或保存溫度較高；標(biāo)準(zhǔn)品中可能不含強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本；廠家試劑質(zhì)量的變化等［3］。試劑、樣品用前未平衡至室溫；蒸餾水質(zhì)有問(wèn)題；待檢樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或受到污染；試劑在使用過(guò)程中受到污染或反復(fù)使用；濃縮洗滌液使用時(shí)有結(jié)晶，未完全溶解；標(biāo)記物使用不正確或者已經(jīng)變質(zhì)；移液吸頭重復(fù)使用、未洗凈或消毒不完全等。

2.2加樣

加樣過(guò)程中的錯(cuò)加、漏加試劑，或底物加量不足、順序顛倒，或混合后加入；移液器計(jì)量不準(zhǔn)，吸頭內(nèi)水分太多或不清潔；樣品離心不完全；反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分；加樣時(shí)交叉污染；樣品數(shù)量較多，加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，加樣后未混勻等。這些情況會(huì)出現(xiàn)白板（顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)反應(yīng)板所有孔均無(wú)顯色）、顯色弱、靈敏度低、假陽(yáng)性、重復(fù)性差等現(xiàn)象。

2.3溫育

在溫育過(guò)程中，培養(yǎng)箱溫度過(guò)高或過(guò)低；溫育時(shí)未按要求貼封片或加蓋，使樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；人為延長(zhǎng)或縮短樣品在培養(yǎng)箱中的溫育時(shí)間，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。這些情況會(huì)出現(xiàn)顯色弱（高）、靈敏度低（高）、重復(fù)性差等。

2.4洗板

洗滌液添加過(guò)多，使孔與孔之間的液體交叉混合，造成反應(yīng)板的污染；洗滌液用量不足或稀釋倍數(shù)不符合要求，洗滌時(shí)沖擊力太大，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或不夠；反應(yīng)板數(shù)量過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)（在室溫較高時(shí)），人為地增加了反應(yīng)時(shí)間；洗液量不足；洗板針堵塞，抽吸不完全：洗板不暢等［4］。這些情況會(huì)出現(xiàn)白板、顯色弱（高）、靈敏度低（高）、假陽(yáng)性、重復(fù)性差等現(xiàn)象。

2.5讀板

讀板時(shí)如果儀器參數(shù)設(shè)定不正確，濾光片不匹配，計(jì)算公式不正確，板底不清潔，酶標(biāo)儀重復(fù)性差等，會(huì)導(dǎo)致靈敏度低、假陽(yáng)性、重復(fù)性差等現(xiàn)象［5］。

2.6操作不當(dāng)

任何不當(dāng)操作都會(huì)影響結(jié)果。

2.7本底偏高及假陽(yáng)性產(chǎn)生

在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，本底偏高甚至造成假陽(yáng)性的結(jié)果是比較嚴(yán)重的問(wèn)題。這主要可能是由以下幾種原因造成：樣品分離不完全；樣品嚴(yán)重溶血或脂血；加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；樣品與稀釋液未充分混勻；酶標(biāo)抗體（抗原）吸附于孔壁或表面；反應(yīng)與顯色時(shí)未加蓋封口膜；溫育時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間、顯色時(shí)間）過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；洗滌液污染或洗滌不徹底；工作環(huán)境溫度過(guò)高。

2.8本底偏低及假陰性產(chǎn)生的原因

本底偏低及假陰性產(chǎn)生的原因主要包括：試劑未平衡至室溫；加樣量不足或樣品過(guò)度稀釋；加樣時(shí)有氣泡；抗原、抗體反應(yīng)時(shí)間或顯色時(shí)間不夠；過(guò)度洗滌；環(huán)境溫度過(guò)低；試劑盒過(guò)期等。

綜上所述，ELISA檢測(cè)技術(shù)是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷客觀等，已廣泛應(yīng)用在各領(lǐng)域的免疫學(xué)檢驗(yàn)中。然而，在ELISA操作過(guò)程中，常會(huì)因試劑、樣品及操作技術(shù)等可控因素而影響結(jié)果的判讀。因此，在試驗(yàn)操作中，操作者必須熟練掌握其基本操作，嚴(yán)格進(jìn)行試劑、樣品的核查，以確保檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。只有加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

3 ELISA測(cè)定中不確定度分量的確定與分析

ELISA的主要操作過(guò)程：樣品準(zhǔn)備（含溶液配制、稀釋等操作））→ELISA檢測(cè)（標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、加樣、溫育、計(jì)時(shí)等）→酶標(biāo)儀讀數(shù)→結(jié)果計(jì)算。

根據(jù)操作流程，結(jié)合操作注意事項(xiàng)的分析，按照測(cè)量不確定度規(guī)范文件的要求及應(yīng)用具體指南中的分析要點(diǎn)，分析ELISA測(cè)定中不確定度的分量，如圖1所示。

圖1　不確定度分量的主要構(gòu)成

ELISA測(cè)定中不確定度的來(lái)源主要由以下要素構(gòu)成：

移液器（包括體積校準(zhǔn)和溫度校準(zhǔn)）、酶標(biāo)儀、溫育溫度、溫育時(shí)間、重復(fù)性、陽(yáng)性對(duì)照（包括吸光度值、平均值、體積及濃度）、陰性對(duì)照（包括吸光度值、平均值、體積及濃度）、樣品（包括吸光度值、平均值及體積）、液層厚度、底物體積、終止液體積等。

根據(jù)《測(cè)量不確定度的要求》、《測(cè)量不確定度表示指南》、《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》、《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》等指導(dǎo)性文件的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)要求［6-11］，結(jié)合國(guó)內(nèi)外的ELISA測(cè)量不確定度的分析方法，本文選取陽(yáng)性對(duì)照吸光度值P進(jìn)行分析，以期為ELISA檢測(cè)不確定度的研究提供分析思路與方法［12-19］。

P是指在某個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)朗伯-比爾定律（A=εbc），吸光度值與吸光系數(shù)（ε），液層厚度（b）和陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照液濃度（C0）成正比。對(duì)于某一特定的顯色反應(yīng)來(lái)說(shuō)，ε是個(gè)常數(shù)，因此P的不確定度主要由b和C0提供。

3.1液層厚度（b）

在ELISA試驗(yàn)中，吸收光從酶標(biāo)板上方垂直通過(guò)液層，因此影響b的主要因素就是溶液層的最終體積，即100 μL底物溶液（V3）+100 μL終止液（V4）。由于在試驗(yàn)中使用的是同樣的加樣器，因此產(chǎn)生的不確定度是相同的，而影響加樣器體積的不確定度主要因素是加樣器的校準(zhǔn)（C）和溫度效應(yīng)（T），它們都屬于B類不確定度。

（1）C產(chǎn)生的不確定度u（C）

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，使用100 μL的加樣器其準(zhǔn)確度為±2%，按矩形分布處理，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（C）=±2%/=1.15（μL）；

（2）T產(chǎn)生的不確定度u（T）

容量器皿的校準(zhǔn)在20℃下進(jìn)行，假設(shè)實(shí)驗(yàn)室的溫度為20℃±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布100 μL加樣器由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（T）=100×4×2.1×10-4=0.084（μL）；

（3）V3引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V3）

由于校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)是2個(gè)相互獨(dú)立的分量，因此V3引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V3）=

（4）V4所引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V4）

同理由100 μL終止液（V4）所引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V4）=u（V3）=1.153（μL）；

因?yàn)閡（V4）和u（V3）是兩個(gè)相互獨(dú)立的兩個(gè)分量，所以b的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度分量u（b）=

需要說(shuō)明的是b的影響需要辨證地看，因?yàn)槿芤后w積變化的同時(shí)也會(huì)使溶液濃度發(fā)生變化，即體積增大，厚度增大，吸光度增大；同時(shí)濃度減小，吸光度下降。為了降低風(fēng)險(xiǎn)，濃度的影響可忽略。

3.2陽(yáng)性對(duì)照液濃度（C0）

C0取決于陽(yáng)性對(duì)照液量（V0）的大小，因此取決于100 μL加樣器的準(zhǔn)確度。同3.1，影響加樣器的體積不確定度的主要因素是C和T，它們都屬于B類不確定度。

u（C）=1.15（μL）；u（T）=0.084（μL）；

因此，u（V0）=u（V3）=u（V4）=1.153（μL）。

因?yàn)橛绊慍0的僅有V0一個(gè)分量，因此C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（C0）=u（V0）=1.153（μL）。

3.3合成P的不確定度

因?yàn)閎和C0是2個(gè)相互獨(dú)立的分量，又是相乘的關(guān)系，根據(jù)公式：

對(duì)于P進(jìn)行n次平行測(cè)定，其結(jié)果如表1所示。

表1　陽(yáng)性對(duì)照（P）的n次重復(fù)測(cè)定結(jié)果

那么P的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（P）計(jì)算如下：

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，涉及的不確定度的分量較多，每個(gè)分量都要根據(jù)自身特點(diǎn)進(jìn)行分析與計(jì)算，形成合成不確定度。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合具體的ELISA實(shí)際操作流程和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分析了ELISA檢測(cè)中出現(xiàn)的主要問(wèn)題及產(chǎn)生的原因，確定了ELISA檢測(cè)過(guò)程中的不確定度分量。根據(jù)質(zhì)量體系對(duì)測(cè)量不確定的要求，結(jié)合國(guó)內(nèi)外的分析方法，選取陽(yáng)性對(duì)照吸光度值P進(jìn)行分析，以期為ELISA檢測(cè)不確定度的研究提供分析思路與方法。

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Analysis of Operational Consideration and Uncertainty of ELISA

Zhang Wei1，F(xiàn)u Pubo1，Gao Hongwei2，Wei Haiyan1，Liang Xinmiao1，Liu Jianli1，Liu Laifu1*
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Afteranalyzing thedetailedoperatingproceduresofELISAmethodssystematically，the operational considerations of ELISA are discussed.According to the requirements of normative documents ofmeasurementuncertainty，thecomponentsofELISAuncertaintypreliminarilybasedonthe consideration factors are analyzed.

ELISA；Operational Consideration；Uncertainty

R446.61

E-mail：zhangwei.cau@163.com；*通訊作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK306）

2015-06-09