馬澤芹王靜劉建禮張猛韓玉田*

（1.煙臺(tái)艾德康生物科技有限公司山東煙臺(tái)264006；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局）

全自動(dòng)酶免分析儀校驗(yàn)方法的建立

馬澤芹1王靜1劉建禮2張猛1韓玉田1*

（1.煙臺(tái)艾德康生物科技有限公司山東煙臺(tái)264006；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局）

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，建立了一套全自動(dòng)酶免分析儀全面校驗(yàn)方法，對(duì)加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)、讀數(shù)系統(tǒng)和全局分別采取模塊式和整體式方法進(jìn)行校驗(yàn)，從而保證各個(gè)模塊的準(zhǔn)確性和整體的可靠性。

全自動(dòng)酶免分析儀；校驗(yàn)方法；加樣系統(tǒng)；孵育系統(tǒng)；洗板系統(tǒng)；讀數(shù)系統(tǒng)

1 前言

全自動(dòng)酶免分析儀是運(yùn)用ELISA測(cè)定的基本原理，集加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)和讀數(shù)系統(tǒng)為一體的綜合檢測(cè)系統(tǒng)，可以全自動(dòng)完成ELISA實(shí)驗(yàn)，目前全自動(dòng)酶免分析儀越來(lái)越多地應(yīng)用于各大醫(yī)院、血站、計(jì)生站和科研單位，它能有效減輕操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，并提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。但不當(dāng)?shù)牟僮骱途S護(hù)以及長(zhǎng)時(shí)間使用可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的較大偏差，因此定期進(jìn)行全自動(dòng)酶免分析儀的校驗(yàn)非常必要［1，2］。以下介紹全自動(dòng)酶免分析儀校驗(yàn)方法的建立。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1加樣系統(tǒng)

萬(wàn)分之一天平：用于測(cè)定加樣純水的質(zhì)量；帶板條的干凈酶標(biāo)板：用于盛放加樣時(shí)的純水；干凈密封性容器：用于盛裝純化水；無(wú)粉手套：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要全程戴手套，以防手上的汗?jié)n、灰塵等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.1.2孵育系統(tǒng)

PT1000的溫度計(jì)：測(cè)量孵育系統(tǒng)的溫度變化，需要經(jīng)過(guò)國(guó)家質(zhì)檢部門的校驗(yàn)，并提供校驗(yàn)報(bào)告。

2.1.3洗板系統(tǒng)

萬(wàn)分之一天平：用于測(cè)定洗板前酶標(biāo)板的質(zhì)量和洗板后酶標(biāo)板的質(zhì)量；帶板條的干凈酶標(biāo)板：用于全自動(dòng)酶免分析儀進(jìn)行洗板過(guò)程；無(wú)粉手套：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要全程戴手套，以防手上的汗?jié)n、灰塵等對(duì)稱量結(jié)果的影響。

2.1.4讀數(shù)系統(tǒng)

標(biāo)準(zhǔn)比色片組：吸光度分別為0.2A、0.5A、1.0A、1.5A，不確定度≤0.01；比色片證書編號(hào)：01268-15-0；廠家編號(hào)：MB1-043。

2.1.5整體性能

酶標(biāo)板：5塊，乙肝每個(gè)項(xiàng)目一塊微孔板；試管：96個(gè)，放置實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的校準(zhǔn)品和血清；蒸餾水：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中代替校準(zhǔn)品、血清、酶等試劑和洗滌液。

2.2方法

2.2.1加樣系統(tǒng)校驗(yàn)

全自動(dòng)酶免分析儀的加樣系統(tǒng)需要定期的校驗(yàn)，以確保加樣量和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。加樣系統(tǒng)校驗(yàn)采用稱量法，此方法操作簡(jiǎn)單，也適用于對(duì)全自動(dòng)加樣系統(tǒng)的日常校正［3］。

2.2.1.1加樣量的精密度

使用純水，每次使用對(duì)應(yīng)的加樣頭加樣，加樣量100 μL，密封性容器。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ竭x擇中，稱量容器質(zhì)量，加注純水后用精密天平稱重，求算加樣純水的質(zhì)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算6次加樣量的變異系數(shù)（CV值，%）。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)加樣通道均進(jìn)行校驗(yàn)。

2.2.1.2加樣量的準(zhǔn)確性

使用純水，每次選擇對(duì)應(yīng)的加樣頭加樣，加樣量100 μL，密封性容器。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ竭x擇中，稱量容器質(zhì)量，加注純水后用精密天平測(cè)量，求算加樣純水的質(zhì)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算6次加樣量的平均值，換算為測(cè)定時(shí)對(duì)應(yīng)溫度下純水的體積，計(jì)算測(cè)試平均值與相對(duì)誤差。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)加樣通道均進(jìn)行校驗(yàn)。

2.2.1.3加樣系統(tǒng)精密度

利用全自動(dòng)酶免分析儀的加樣系統(tǒng)，加100 μL檸檬黃溶液至96孔酶標(biāo)板內(nèi)。此檸檬黃液體需要按特定的比例配制，要求配置的液體用酶標(biāo)儀測(cè)試時(shí)的讀數(shù)在1.0-1.5之間。加樣系統(tǒng)自動(dòng)分液100 μL/孔后，使用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)測(cè)量加樣后酶標(biāo)板的OD值，記錄并分析加樣96孔酶標(biāo)板的精密性。

2.2.2孵育系統(tǒng)校驗(yàn)

利用全自動(dòng)酶免分析儀的控制軟件，開啟孵育器的溫度，溫度設(shè)定在待測(cè)溫度。將PT1000溫度計(jì)貼在孵育器上面，待溫度相對(duì)穩(wěn)定在待測(cè)溫度后，分別記錄孵育器5個(gè)點(diǎn)（周圍4點(diǎn)和中間的1點(diǎn)）的溫度測(cè)定值。在1 h內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次并記錄，取平均值與標(biāo)示值之差（即偏差），最大值與最小值之差的一半為波動(dòng)性。全自動(dòng)酶免分析儀的孵育系統(tǒng)是獨(dú)立的控溫孵育器組成，所以每個(gè)獨(dú)立的孵育模塊均要進(jìn)行溫度的校驗(yàn)。

2.2.3洗板系統(tǒng)校驗(yàn)

取96孔酶標(biāo)板稱重并記錄酶標(biāo)板質(zhì)量，全自動(dòng)酶免分析儀利用軟件控制對(duì)酶標(biāo)板用蒸餾水進(jìn)行板式洗滌1次后再稱重并記錄酶標(biāo)板的質(zhì)量，將洗滌后酶標(biāo)板的質(zhì)量減去洗滌前酶標(biāo)板的質(zhì)量，然后換算成體積單位，除以96為每孔殘液量，洗板機(jī)的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)為每孔≤2 μL［4］。

2.2.4讀數(shù)系統(tǒng)校驗(yàn)

讀數(shù)系統(tǒng)的校驗(yàn)是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程》（JJG861-2007）進(jìn)行［5］。在校驗(yàn)酶標(biāo)儀時(shí)，需先將酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min。

2.2.4.1示值穩(wěn)定性（漂移）

選用450 nm、630 nm，標(biāo)稱1.0的標(biāo)準(zhǔn)濾光片放置到空微板架，以空氣做參比讀數(shù)，測(cè)量并記下儀器初始值，5 min后記錄儀器示值，10 min后再次記錄儀器示值，求出兩次吸光度示值的最大值，按照公式（1）計(jì)算示值穩(wěn)定性。示值穩(wěn)定性的校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)≤±0.005。

式中：Ai-第i次測(cè)量的吸光度值；

A初始-儀器的初始值。

2.2.4.2吸光度示值誤差（準(zhǔn)確度）

選用450 nm、630 nm中性濾光片放到空微板架上，以空氣做參比連續(xù)讀3次。依次記錄儀器示值，并計(jì)算平均值。示值誤差ΔA按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中：Ai-第i次測(cè)量的吸光度值；

As-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)值。

儀器吸光度示值誤差結(jié)果的報(bào)告以450 nm、630 nm下，通過(guò)測(cè)量計(jì)算得到的吸光度示值誤差的最大值得出。吸光度示值誤差的校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為≤±0.03。

2.2.4.3吸光度重復(fù)性的測(cè)量

選用450 nm、630 nm波長(zhǎng)，將吸光度標(biāo)稱值為0.5或者1.0的光譜中性濾光片放到空微板架上，以空氣為參比，于固定的某一孔位測(cè)量6次，記錄儀器示值，并計(jì)算平均值，按照公式（3）計(jì)算RSD值，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD值）表示儀器吸光度值的重復(fù)性。RSD的校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為≤1%。

其中：xi-第i次測(cè)量的結(jié)果；

xˉ-n次測(cè)量結(jié)果的吸光度平均值；

n-測(cè)量的次數(shù)。

2.2.4.4通道差異的測(cè)定

選用450 nm、630 nm波長(zhǎng)，將吸光度為1.0的光譜中性濾光片放在空的酶標(biāo)板架上，先后置于每個(gè)通道相應(yīng)的位置上，以空氣作為參比，測(cè)量并記錄每個(gè)通道至少6次的吸光度值。多個(gè)通道的差異結(jié)果報(bào)告用全部測(cè)量數(shù)據(jù)的極差表示按照公式（4）計(jì)算通道差異δA。

式中：Amax-多個(gè)通道測(cè)量結(jié)果的吸光度最大值；

Amin-多個(gè)通道測(cè)量結(jié)果的吸光度最小值；

δA-通道差異。

2.2.5整體性能

全自動(dòng)酶免分析儀的整體性能通過(guò)用水模擬實(shí)驗(yàn)過(guò)程的方式進(jìn)行校驗(yàn)。以乙肝五項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行整體性能的校驗(yàn)，在全自動(dòng)酶免分析儀軟件上編輯乙肝五項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用一次性加樣頭、校準(zhǔn)品和血清（用蒸餾水代替）、酶等試劑和洗滌液（用蒸餾水代替）、酶標(biāo)板。然后利用全自動(dòng)酶免分析儀同時(shí)運(yùn)行乙肝五項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法。其中實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的孵育時(shí)間可以設(shè)置成5 min。

3 結(jié)果

3.1加樣系統(tǒng)

3.1.1加樣量的精密度

結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)試4個(gè)加樣通道的加樣量，其加樣量的變異系數(shù)分別為0.5%、0.6%、0.6%、0.5%。

3.1.2加樣量的準(zhǔn)確性

結(jié)果見(jiàn)表1。通道1測(cè)試6次平均值與100 μL之間的差異為1.1 μL，其他3個(gè)通道的差異為0.5 μL、1.0 μL、1.0 μL。

表1　加樣量精密度和準(zhǔn)確性

3.1.3加樣系統(tǒng)精密度

結(jié)果見(jiàn)表2。利用4通道加樣系統(tǒng)進(jìn)行分液，測(cè)試整板的OD值，其CV為1.3%，加樣的誤差完全符合實(shí)驗(yàn)的要求。

表2　加樣系統(tǒng)精密度

3.2孵育系統(tǒng)

表3為一個(gè)獨(dú)立孵育模塊的測(cè)試結(jié)果。

表3　孵育模塊溫度測(cè)試數(shù)據(jù)（單位℃）

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上看，孵育模塊的溫度偏差（平均值與標(biāo)示值之差）為37.172-37=0.172℃；波動(dòng)性（最大值與最小值之差）為37.7-36.4=1.3℃。

3.3洗板系統(tǒng)

洗滌前酶標(biāo)板的質(zhì)量為24.534 g，洗滌后為24.378 g，洗滌前后質(zhì)量差為0.156 g，換算成體積為156 μL。因每酶標(biāo)板上有96孔，所以每孔的殘液量為156 μL/96=1.625 μL。

3.4讀數(shù)系統(tǒng)

3.4.1示值穩(wěn)定性

表4為示值穩(wěn)定性的試驗(yàn)結(jié)果。

表4　示值穩(wěn)定性

r=1.0045-1.002=0.0025，符合標(biāo)準(zhǔn)要求（≤±0.005）。

3.4.2吸光度示值誤差

表5為吸光度示值誤差的試驗(yàn)結(jié)果。

表5　吸光度示值誤差

結(jié)果顯示，吸光度示值誤差符合標(biāo)準(zhǔn)要求（≤± 0.03）。

3.4.3吸光度重復(fù)性

表6為吸光度重復(fù)性的測(cè)量結(jié)果。

表6　吸光度重復(fù)性

結(jié)果顯示，吸光度重復(fù)性符合標(biāo)準(zhǔn)要求（RSD≤1%）。

3.4.4通道差異的測(cè)定通道差異的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7　通道差異

3.5整體性能

此整體性能的測(cè)試，主要檢測(cè)全自動(dòng)酶免分析儀各個(gè)模塊的運(yùn)行情況，在檢測(cè)過(guò)程中要達(dá)到各模塊之間配合協(xié)調(diào)，運(yùn)行流暢。此項(xiàng)目的檢測(cè)并不產(chǎn)生具體的數(shù)據(jù)結(jié)果。

4 討論

4.1環(huán)境對(duì)加樣精度的影響

全自動(dòng)酶免分析儀在使用和校驗(yàn)時(shí)，對(duì)環(huán)境的溫度有特殊的要求。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度的變化對(duì)加樣系統(tǒng)的加樣精度有很大的影響，可能導(dǎo)致加樣精度的不準(zhǔn)確，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差甚至造成弱陽(yáng)性樣本的漏檢［6］。所以在對(duì)全自動(dòng)酶免分析儀進(jìn)行使用和校驗(yàn)時(shí)，要保證實(shí)驗(yàn)室的溫度恒定并根據(jù)不同儀器的使用環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境進(jìn)行設(shè)置。

4.2洗板機(jī)的維護(hù)

幾乎所有試劑盒中的洗液都是需要經(jīng)過(guò)稀釋才可以使用，雖然洗液的濃度比較低，但是這些洗液在洗板機(jī)和管路中存留的時(shí)間過(guò)久之后，還是會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生。結(jié)晶的時(shí)間過(guò)久會(huì)不容易清理。而當(dāng)洗板機(jī)和管路中有結(jié)晶存在時(shí)，測(cè)量出的每孔殘留量是不準(zhǔn)確的，所以全自動(dòng)酶免分析儀在使用之后，需要用蒸餾水對(duì)洗板機(jī)和管路進(jìn)行沖洗，以防洗板機(jī)和管路中產(chǎn)生結(jié)晶，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

4.3讀數(shù)儀的校驗(yàn)

在全自動(dòng)酶免分析儀中，讀數(shù)儀是一個(gè)單獨(dú)的模塊，可以單獨(dú)進(jìn)行校驗(yàn)。有些大的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院已經(jīng)形成了一套成熟的對(duì)讀數(shù)儀進(jìn)行校驗(yàn)的方法，在此情況下，讀數(shù)儀的校驗(yàn)方法和流程可以按照實(shí)驗(yàn)室的校驗(yàn)方法進(jìn)行。

5 結(jié)論

全自動(dòng)酶免分析儀是集加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)和讀數(shù)系統(tǒng)為一體的綜合檢測(cè)系統(tǒng)，其校驗(yàn)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，必須針對(duì)機(jī)器的特性，采用模塊式和整體式相結(jié)合的方式對(duì)其進(jìn)行科學(xué)、全面校驗(yàn)，這樣才能保證臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所得數(shù)據(jù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

［1］欒燕，沈光，劉顯智.血站儀器設(shè)備管理淺析［J］.中國(guó)輸血雜志，2009，22（1）：17-18.

［2］李明生.血站儀器設(shè)備檢定和校準(zhǔn)的思索與體會(huì)［J］.臨床輸血與檢驗(yàn)，2005，7（4）：299-300.

［3］楊青成，鄭康林，宋冬云.對(duì)全自動(dòng)加樣系統(tǒng)校正的探討［J］.中國(guó)輸血雜志，2004，17（3）：164-165.

［4］張?jiān)?，李竹?自動(dòng)洗板機(jī)校準(zhǔn)方法的研究［J］.中國(guó)計(jì)量，2013，4：102-103.

［5］JJG861-2007酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程［S］.

［6］費(fèi)榮，張立波，馬貴明.環(huán)境溫度變化對(duì)全自動(dòng)加樣器影響分析［J］.臨床血液學(xué)雜志，2013，26（6）：410-411.

Envisage of Calibration Methods of Fully Automated ELISA Analyzer

Ma Zeqin1，Wang Jing1，Liu Jianli2，Zhang Meng1，Han Yutian1*
（1.Yantai Addcare Bio-Tech Limited Company，Yantai，Shandong，264006；2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

To ensure the accuracy and reliability of experimental results，an overall calibration method of Fully Automated Elisa Analyzer is established.Modular and unitary verification of pipetting system，incubation system，washing system，reading system and the whole system ensures the accuracy and reliability of each modles and overall performance respectively.

Fully Automated Elisa Analyzer；Test Method；Pipetting System；Incubation System；Washing System；Reading System

R446.61

E-mail：mazeqin@addcare.cn；*通訊作者E-mail：hanyutian@addcare.cn

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK306）

2015-06-09