劉建禮 王飛 徐惠芳 魏海燕 張偉 劉來福

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026）

ELISA質(zhì)控血清配制方法的研究

劉建禮 王飛 徐惠芳 魏海燕 張偉 劉來福*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026）

［目的］探討HIV ELISA檢測質(zhì)控血清配制的關(guān)鍵影響因素及方法。［方法］選擇HIV陽性血清以陰性血清進(jìn)行系列稀釋，直至獲得S/CO=2-3之間的質(zhì)控血清，以PBS、牛血清白蛋白、二甲基亞砜（DMSO）、甘油等組成不同稀釋液，探討各種稀釋液與陰性血清稀釋效果的不同。［結(jié)果］HIV強(qiáng)陽性血清在稀釋初期，S/CO值下降緩慢，在S/CO值下降至15以下時，可以用倍比稀釋的方法獲得相應(yīng)靶值的質(zhì)控血清；PBS、PBS+10%BSA、陰性血清、陰性血清+10%DMSO、陰性血清+10%甘油作為稀釋液，獲得的質(zhì)控血清S/CO值差別不明顯。［結(jié)論］強(qiáng)陽性血清須先采用高倍數(shù)稀釋，然后再進(jìn)行倍比稀釋尋找S/CO在2-3的最終稀釋度；PBS加BSA可以替代陰性血清作為稀釋液。

質(zhì)控血清；配制方法；稀釋液

1 前言

質(zhì)控血清一般采用陽性血清稀釋的方法進(jìn)行配置，但配置過程涉及到陽性樣本和稀釋液的選擇、保護(hù)劑和防腐劑的添加與否、靶值和稀釋終點(diǎn)的確定等系列環(huán)節(jié)。本研究對內(nèi)部血清配置的過程和這些關(guān)鍵影響因素進(jìn)行探討，以期獲得穩(wěn)定可靠的質(zhì)控血清。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1主要試劑

（1）HIV初篩試劑

ELISA雙抗原夾心法HIV（1+2）試劑盒：上海科華生物工程股份有限公司，批號20091014；北京萬泰生物藥業(yè)有限公司，批號20090708；廈門英科新創(chuàng)科技有限公司，批號20081226；珠海麗珠試劑有限公司，批號20080806；生物梅里埃公司Vironostika，批號A57BA。

（2）HIV抗體確認(rèn)試劑

WB確認(rèn)試劑：新加坡Genelabs公司，批號AE6013。

（3）甘油：分析純，北京五洲世紀(jì)化工；二甲基亞砜（DMSO）：德國SIGMA公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白：批號2013262，賽寶生物。

2.1.2儀器設(shè)備

Alisei全自動酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)：意大利SEAC公司。

2.2方法

2.2.1陽性血清的選擇

本研究所用HIV陽性樣本為出入境人群中檢出的HIV陽性血清。所有陽性樣本均經(jīng)以上5種HIV ELISA檢測試劑盒檢測為陽性，并經(jīng)WB確證為陽性。

2.2.2陰性血清的選擇

本研究所用陰性血清為從日常檢測樣品中收集到的正常人血清，它們要求必須為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性，同時要求無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜顆粒、絮狀沉淀物。這些血清經(jīng)56℃30 min滅活補(bǔ)體，并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾除菌備用。

2.2.3質(zhì)控血清的配制

對選擇的強(qiáng)陽性HIV血清首先進(jìn)行10倍系列稀釋并進(jìn)行ELISA檢測，至S/CO值開始出現(xiàn)明顯下降，并且OD值出現(xiàn)在3.5以下時作為獲得的稀釋血清作為母液，再進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024系列2倍稀釋，以HIV ELISA試劑檢測其S/CO值，選擇S/CO值在2-3之間的稀釋度作為最終稀釋度。以陰性血清或各種待選樣品稀釋液以上述選定的稀釋度進(jìn)行稀釋分裝，獲得質(zhì)控血清。

2.2.4不同稀釋液的影響

對不同稀釋液稀釋獲得的質(zhì)控血清進(jìn)行ELISA測試，比較其S/CO差異，以確定基質(zhì)效應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1陽性血清的選擇

本研究所選擇的陽性血清經(jīng)5種試劑檢測，其S/CO值均在20以上，樣本OD值均接近于4.00；WB確證結(jié)果為全條帶。具體結(jié)果見表1。

表1　強(qiáng)陽性血清不同試劑的ELISA檢測結(jié)果

3.2稀釋度的確定

對上述選定的HIV陽性血清先進(jìn)行10倍系列稀釋，以生物梅里埃試劑檢測其S/CO值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1000倍稀釋下其S/CO值出現(xiàn)下降至15.48，OD值下降至3.5以下。因此1000倍稀釋液作為母液，進(jìn)行下面的倍比稀釋，分別以5種試劑進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

表2　不同試劑倍比稀釋檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，在同一稀釋倍數(shù)下，不同試劑測得的S/CO值差距很大；而同一試劑結(jié)果中，稀釋倍數(shù)與S/CO值無明顯的直線關(guān)系或?qū)Ρ汝P(guān)系。萬泰試劑在陽性樣本64倍稀釋獲得的S/CO值為2.34；科華試劑在64和128倍稀釋度范圍內(nèi)獲得的S/CO分別為3.15和1.98；英科試劑在樣本32倍和64倍稀釋分別得到了3.32和1.77的S/CO值；麗珠試劑在64倍稀釋處測得S/CO值為2.75；生物梅里埃試劑在32和64倍稀釋處分別測得S/CO值為3.33和1.89。

3.3稀釋液對質(zhì)控血清測定值的影響

分別以PBS、PBS+10%牛血清白蛋白、陰性血清、陰性血清+10%DMSO、陰性血清+10%甘油做為稀釋液，對HIV陽性血清進(jìn)行稀釋，以生物梅里埃試劑測定其比色值并比較各組之間的差異。結(jié)果顯示，各組檢測所得S/CO值差別不明顯，單用PBS組比陰性血清稀釋組總體偏低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異并不顯著（T檢驗(yàn)，P＞0.05），PBS+BSA組的均值則與陰性血清組非常接近；陰性血清中添加DMSO和甘油對樣本的ELISA檢測結(jié)果也沒有明顯影響。

表3　不同稀釋液對質(zhì)控血清檢測值的影響

4 討論

ELISA檢測S/CO值在2-3的陽性血清被稱為臨界值血清，臨界值血清是HIV檢測實(shí)驗(yàn)室對日常檢測工作質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控的最常用質(zhì)控血清。臨界值血清敏感性好，檢測過程中微小的變化都可引起臨界值的偏移［1，2］。理想的臨界值血清應(yīng)該是天然的HIV抗體弱陽性血清，也就是急性感染后HIV抗體陽轉(zhuǎn)期的血清，但是這種血清一般很難得到，獲得的量也很難滿足長期質(zhì)控需要，因此，臨界值質(zhì)控血清通常采用HIV強(qiáng)陽性血清稀釋的方法獲得［3，4］。

HIV強(qiáng)陽性血清稀釋獲得臨界值質(zhì)控血清的過程中，首先要選擇高質(zhì)量的陽性血清，陽性血清須經(jīng)幾種HIV檢測試劑初篩和WB確證，以確保陽性可靠性。同時，為了增加質(zhì)控血清的覆蓋范圍，最好將幾份不同的強(qiáng)陽性血清混合，在WB檢測中呈現(xiàn)全條帶，這樣的陽性血清能夠確保其中含有種類足夠多的抗體類型，以保證靈敏度和對各種不同試劑的敏感性。

需要注意的是，強(qiáng)陽性血清ELISA檢測獲得的S/CO值僅僅代表一種定性的判斷，并不具有實(shí)際的定量意義，不同試劑獲得的S/CO值也不具有可比性。這是因?yàn)棰俑髟噭┙o出的S/CO只是為了判定陰陽性的作為臨界值的一種參照，并不是真正的意義上的定量值；②由于各試劑廠家使用的單抗活性不同，檢測最后獲得的OD值只針對這種特定的試劑有一定的定量參考意義；③強(qiáng)陽性血清測定獲得的OD值一般都在3.5以上，甚至基本都達(dá)到4.0左右，這些值已經(jīng)處在了酶標(biāo)儀比色檢測的上限，反應(yīng)變色與酶標(biāo)儀讀數(shù)值已經(jīng)不在線性范圍之內(nèi)［5，6］。

選定陽性血清后，接下來要確定合適的稀釋倍數(shù)，以便稀釋獲得S/CO在2-3范圍內(nèi)的質(zhì)控血清。如上所述，強(qiáng)陽性血清檢測產(chǎn)生的OD值往往已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了酶標(biāo)儀的檢測上限，因此，第一步一般采用大比例（如10倍系列）稀釋的辦法找到OD值落在酶標(biāo)儀線性區(qū)間（一般在3.5以下）的稀釋度。本研究中，HIV強(qiáng)陽性血清經(jīng)10倍、100倍稀釋，檢測的S/CO值基本無變化，OD值4.0左右，直到1000倍稀釋，才出現(xiàn)S/CO值的明顯變化，OD值下降到了3.3（生物梅里埃試劑）左右。這進(jìn)一步說明了選取的HIV強(qiáng)陽性血清ELISA檢測信號開始是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了酶標(biāo)儀的檢測上限。進(jìn)入酶標(biāo)儀檢測限之后，就可以采用倍比稀釋的方法進(jìn)一步尋找獲得S/CO為2-3的稀釋度了。

陽性樣本稀釋時，稀釋液的選擇也是一個需要關(guān)注的問題。一方面，所用稀釋液需要盡量考慮保持樣本中抗體的天然狀態(tài)，維持一個適用于抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境，在pH值、離子強(qiáng)度、離子滲透壓、膠體滲透壓、溶解極性等條件應(yīng)盡量保持與生理狀態(tài)下一致；另一方面，還要注意所用稀釋液不能存在干擾抗原抗體反應(yīng)的成分。理想的稀釋液必須盡量滿足上述兩方面的要求。另外，為了后期保存的穩(wěn)定性，稀釋液中可能需要添加一些防腐和保護(hù)成分，這些成分也必須不能對樣本的檢測值發(fā)生影響［7］。

一般認(rèn)為，正常人血清是最理想的稀釋液［5］，因?yàn)檫@樣最大程度地保持了抗體的原始生理狀態(tài)，同時也保證了質(zhì)控樣本與檢測樣本的反應(yīng)環(huán)境的一致性。但是，由于血清成分復(fù)雜，尤其是蛋白種類非常復(fù)雜，不同批次血清中的質(zhì)量有很大差別，其中的很多未知蛋白，包括不同供血者體內(nèi)的某些特異性蛋白，都可能對抗原抗體的反應(yīng)造成干擾，人血清中大量存在的免疫球蛋白也可能與ELSIA檢測試劑中的的特異抗體發(fā)生反應(yīng)。例如自身免疫病患者常有可與抗體反應(yīng)的類風(fēng)濕因子（RF），人體針對動物免疫球蛋白的嗜異性天然抗體相當(dāng)普遍，自身抗體和嗜異性天然抗體的存在通常會引起假陽性反應(yīng)［6］。另外，血液里的補(bǔ)體成分也能與抗體反應(yīng)，從而干擾試劑抗體結(jié)合抗原及與次級抗體反應(yīng)的能力，可引起假陰性，因此，用陰性血清做稀釋液具有較大的不確定性。本研究結(jié)果顯示，單純用PBS作為稀釋液，檢測的S/CO值要比陰性血清偏低，但用PBS+BSA則與陰性血清十分接近?？紤]到PBS+BSA成分相比而言更簡單，質(zhì)量可控，pH值、滲透壓、離子強(qiáng)度等關(guān)鍵溶液因素也基本等同于血清，同時據(jù)報道，BSADMSO和甘油是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的凍存保護(hù)劑，可以減少凍融過程對蛋白質(zhì)活性的損害。在質(zhì)控血清的保存和使用過程中，反復(fù)凍融是造成抗體滴度降低的主要因素之一［7，8］，加入一些防凍保護(hù)劑將有可能降低反復(fù)凍融對抗體水平的影響。本研究結(jié)果證明了DMSO和甘油本身對樣本的檢測值不產(chǎn)生明顯干擾，可以考慮用作凍存保護(hù)劑。

對抗體活性具有一定的保護(hù)作用。因此，PBS+BSA是比較理想的稀釋液。

5 結(jié)論

質(zhì)控血清的配制需要首先對強(qiáng)陽性血清進(jìn)行高倍數(shù)稀釋，然后再進(jìn)行倍比稀釋確定S/CO值為2-3的最終稀釋度；PBS加BSA可以替代陰性血清作為稀釋液。

［1］王治國.臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［2］謝益君.ELISA法檢測HIV的室內(nèi)質(zhì)量控制［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，19：12.

［3］胡靜云，陳善昌.ELISA檢測HIV抗體室內(nèi)質(zhì)控血清的制備與應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27：553.

［4］劉芳，胡斌，何蘊(yùn)韶.聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測HIV抗體的質(zhì)量控制方法探討［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8：796-797.

［5］李敬云.艾滋病檢測方法與應(yīng)用［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2006.

［6］中國疾病控制預(yù)防中心.全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范［M］.2009年修訂版.

［7］楊春暉，張容，鄭鵬.影響抗-HIV弱陽性質(zhì)控血清穩(wěn)定性的幾種因素探討［J］.中國輸血雜志，2008，21（6）：441-443.

［8］徐霞，胡金權(quán).酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制方法的評價［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（1）：30-32.

Preparation of External Quality Control Serum for ELISA Test

Liu Jianli，Wang Fei，Xu Huifang，Wei Haiyan，Zhang Wei，Liu Laifu*
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026）

［Objective］To explore the crucial factors in the preparation of external quality control serum for HIV ELISA test.［Methods］HIV positive serum was confirmed by ELISA and Western blotting，then it was diluted by HIV negative normal serum until the S/CO value reached 2 to 3 in ELISA test.Four different dilutions were also used and compared with normal serum by S/CO value.［Results］Strong positive serum selected showed high S/CO value of 21 to 30.The value did not decrease notably until it reached the value blow 15，after that control serum of OD value 2 to 3 could be made by double？ratio？dilution.PBS，PBS+BSA did not show difference compared with normal serum when they were used as dilution.［Conclusion］Strong positive HIV serum often has high value of S/CO，high ratio dilution should be made before the value decrease notably，then control serum of 2-3 value could be made by serial dilution.PBS+BSA could be a substitute of normal serum as dilution.

Quality Control Serum；Preparation；ELISA

R446.61

E-mail：liujianlibj@163.com；*通訊作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK306）

2015-06-09